丹蔘酮IIA抑制miR-376b-5p降低急性心肌梗死大鼠致炎細胞因子分泌並減輕心肌損傷研究

急性心肌梗死（ acute myocardial infarction ， AMI ）是由遺傳因素和環境因素共同作用引起的一種常見的心血管疾病，具有高患病率、高死亡率和高致殘率的特點，已超過癌症成爲威脅人類健康和生命最大的疾病 [1-3] 。目前臨牀治療 AMI 方法雖取得一定療效，但 AMI 致死率和致殘率仍然很高，治療結果仍不理想。究其主要原因是 AMI 患者心室重構導致患者心臟功能不可逆損害 [4-5] 。因此，目前迫切需要尋找抑制 AMI 患者心室重構的新靶點及其藥物，爲治療 AMI 提供新的臨牀策略和思路。

微小 RNA （ microRNA ， miRNA ）是一類非編碼小分子 RNA ，是轉錄後水平基因表達調控過程中重要的調節因子。 miRNA 參與生物多種生理過程的調節，如細胞增殖、分化、凋亡等，且廣泛參與生命過程與疾病發生和發展 [6-7] 。 miRNA 還可參與心肌纖維化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理變化過程，促進或抑制心肌細胞死亡，調節缺血後新血管形成。目前大量的 miRNA 被發現參與了心室重構的發生發展過程，包括 miR-144 、 miR-133 、 miR-99a 、 miR-30 及 miR-34 等 [8-9] 。 Pan 等 [10] 發現 M3 亞型乙酰膽鹼受體可通過抑制 miR-376b-5p 來發揮心肌保護作用。研究報道， iv miR-144 能夠調控細胞自噬，降低纖維化，進而對 AMI 小鼠心室重構具有促進作用 [11] 。炎症反應能引起 AMI 病理過程中的心室重構。炎症是 AMI 患者的心室重構和心肌纖維化的主要病理機制之一。研究表明，心肌梗死後會導致內源性免疫系統激活，導致炎性介質的大量釋放，進而促使炎性細胞的遷移，加速心肌細胞的再次損傷，釋放大量的炎性物質，加速心肌組織纖維化和心肌細胞凋亡 [12-13] 。這爲其他 miRNA 緩解或防治 AMI 小鼠心室重構提供了理論和實驗基礎。

丹蔘酮 II A[14-15] 靶向 miRNA 對多種心血管疾病頗具療效，這爲治療 AMI 心室重構提供了新的視角和機遇。本課題組前期研究發現， miR-376b-5p 在逆轉老年自發性高血壓大鼠大鼠左室重構中發揮重要作用，且已證實過表達 miR-376b-5p 可消除丹蔘酮對自發性高血壓大鼠大鼠心室重構的改善效果，表明 miR-376b-5p 表達是大鼠心室重構重要途徑，這爲 miR-376b-5p 在 AMI 大鼠心室重構提供了研究基礎 [16] 。因此， miR-376b-5p 可作爲治療 AMI 大鼠心室重構重要靶點。但 miR-376b-5p 調控 AMI 大鼠心室重構具體機制尚不清楚。因此，本研究擬探究丹蔘酮 II A 以及 miR-376b-5p 在改善 AMI 大鼠心室重構中的作用及其作用機制。

1材料

1.1 動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 50 只， 8 周齡，體質量 220 ～ 240 g ，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號 SCXK （瀘） 2020-0007 。 SD 大鼠於內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院動物實驗中心 SPF 級實驗動物室飼養，每籠 5 只，溫度 22 ～ 25 ℃，相對溼度 60% ～ 70% ，自由進食飲水。動物實驗經內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批准（批准號 BYYFY-2022-0008 ）。

1.2 藥品與試劑

丹蔘酮 II A 磺酸鈉注射液（批號 H31022558 ）購自上海上藥第一生化藥業有限公司；腫瘤壞死因子 -α （ tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）試劑盒（批號 H052-1-1 ）、白細胞介素 -1β （ interleukin-1β ， IL-1β ）試劑盒（批號 H002-1-1 ）、磷酸肌酸激酶同工酶（ creatine kinase-myocardial band ， CK-MB ）試劑盒（批號 H197-1-1 ）、乳酸脫氫酶（ lactate dehydrogenase ， LDH ）試劑盒（批號 A020-2-2 ）均購自南京建成生物科技有限公司；兔抗 I 型膠原蛋白（ collagen type I ， Col1 ）抗體（批號 YT6135 ）、兔抗 α- 平滑肌肌動蛋白（ α-smooth muscle actin ， α-SMA ）抗體（批號 YT5053 ）、兔抗 SMAD 家族成員 2 （ SMAD family member 2 ， Smad2 ）抗體（批號 YM3364 ）、兔抗 Smad3 抗體（批號 YT4334 ）、兔抗磷酸化 SMAD2 （ phosphorylated Smad2 ， p-Smad2 ）抗體（批號 YP0362 ）、兔抗 p-Smad3 抗體（批號 YP0585 ）、兔抗 Smad7 抗體（批號 YN2330 ）、兔抗 Rho 相關螺旋捲曲蛋白激酶 1 （ Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1 ， ROCK1 ）抗體（批號 YT4162 ）、兔抗 ROCK2 抗體（批號 YT4163 ）、兔抗纖連蛋白（ fibronectin ， FN ）抗體（批號 YM3137 ）、兔抗轉化生長因子 -β1 （ transforming growth factor-β1 ， TGF-β1 ）抗體（批號 YT4632 ）、兔抗同源基因家族成員 A （ Ras homolog gene family member A ， RhoA ）抗體（批號 YT4077 ）、鼠抗 III 型膠原蛋白（ collagen type III ， Col3 ）抗體（批號 YM6374 ）、鼠抗 β-actin 抗體（批號 YM3028 ）均購自 ImmunoWay Biotechnology 公司； HRP 標記的山羊抗兔 IgG 抗體（批號 D110058 ）、 HRP 標記的山羊抗鼠 IgG 抗體（批號 D110087 ）、 HRP 標記的鏈黴卵白素工作液（批號 D111054 ）、牛血清白蛋白（ bovine serum albumin ， BSA ，批號 B600036 ）、 BCA 蛋白測定試劑盒（批號 C503021 ）、二氨基聯苯胺（ diaminobenzidine ， DAB ）試劑盒（批號 C520017 ）均購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司；高表達 miR-376b-5p 的慢病毒載體購自上海譽宴生物技術服務中心； miR-376b-5p 模擬物（ miR-376b-5p mimics ： F: 5’-GGGTGGATATTCC- TTCTA-3’ ， R: 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’ ）、 miR-376b-5p 抑制物（miR-376b-5p inhibitor ：5’-AAACAUAGAAGGAAUAUCCACG-3’ ）由上海吉凱基因公司合成。

1.3 儀器

BH-2 型光學顯微鏡（日本 Olympus 公司）； QuantStudio 6 Flex qRT-PCR 儀（美國 ABI 公司）； MultiskanGo 1510 型全波段酶標儀（美國 Thermo 公司）； Power Pac 1645050 型免疫印跡組件、 TransBlotSD 1703940 型垂直電泳轉印系統、 Universal Hood- II 型凝膠成像儀（美國 Bio-Rad 公司）。

2方法

2.1AMI大鼠模型建立、分組和給藥

SD 大鼠適應性飼養 1 周後，隨機分成假手術組、模型組、丹蔘酮 II A （ 5 mL/kg ）組、 miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組，每組 10 只。採用大鼠冠狀動脈前降支結紮法構建 AMI 大鼠模型，假手術組除不結紮外其餘步驟均同造模組。 AMI 心室重構模型成功後，丹蔘酮 II A 組 ig 丹蔘酮 II A 磺酸鈉注射液， 1 次 /d ，連續 12 周； miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組分別先將大鼠轉染 miR-376b-5p mimics 載體和 miR-376b-5p inhibitor 載體，按上述造模方法構建動物模型，以標準飼料餵養，造模成功後 ig 丹蔘酮 II A 磺酸鈉注射液，同時尾 iv 0.1 mL miR-376b-5p mimics 載體或 miR-376b-5p inhibitor 載體， 1 次 /d ，連續 12 周 [16] 。

2.2ELISA檢測大鼠血清中炎症因子水平

給藥結束後， 按照 Hou 等 [17] 方法收集各組大鼠腹主動脈血清，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測血清中 TNF-α 、 IL-1β 水平和 LDH 、 CK-MB 活力。

2.3 大鼠心臟組織病理及纖維化程度觀察

處死大鼠，每組隨機選取 5 只大鼠摘取左心室，用 4% 多聚甲醛固定後分離幷包埋在石蠟中， 4 µm 切片。隨後按照 Shi 等 [18] 方法將心臟樣本分別進行蘇木素 - 伊紅（ HE ）染色和 Masson 染色，於顯微鏡下觀察並拍照，評估心臟組織病理變化和心肌細胞纖維化程度。

2.4 免疫組化檢測心肌組織Col1、Col3和α-SMA蛋白 表達

取心肌組織切片， 脫蠟、水化，滴加 30 mol/L 過氧化氫於室溫下孵育 10 min ；切片置於枸櫞酸鹽緩衝液中， 95 ℃加熱 10 min 後室溫冷卻；用 3% 雙氧水孵育 30 min ， 1% BSA 孵育 30 min ，分別滴加兔抗 Col1 抗體（ 1 ∶ 300 ）、兔抗 Col3 抗體（ 1 ∶ 200 ）和兔抗 α-SMA 抗體（ 1 ∶ 200 ）， 37 ℃孵育 1 h ；然後在 37 ℃下加入 HRP 標記的二抗孵育 1 h ，利用 DAB 檢測免疫反應活性。切片用蘇木素染色，利用光學顯微鏡進行拍照，採用 Image J 13.0 軟件測定染色陽性細胞吸光度（ A ）值。

2.5qRT-PCR檢測心肌組織miR-376b-5p表達

按照試劑盒說明書提取心肌組織總 RNA 併合成 cDNA ，進行 qRT-PCR 分析。引物序列： miR-376b-5p 上游引物 5’-GGGTGGATATTCCTTCTA-3’ ，下游引物 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’ ； GAPDH 上游引物 5’-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’ ，下游引物 5’-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3’ 。

2.6Western blotting檢測心肌組織TGF-β1/Smad和RhoA/ROCK信號通路相關蛋白表達

取各組大鼠心肌組織，加入 RIPA 裂解液提取蛋白，採用 BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至 PVDF 膜，加入一抗 4 ℃孵育過夜後，孵育二抗，採用凝膠成像儀拍照。

2.7 統計學分析

採用 SPSS 22.0 進行數據處理和統計學分析，數據均以 表示，採用單因素方差分析（ One-way ANOVA ）法進行多組間差異分析。

3 結果

3.1 丹蔘酮IIA抑制AMI大鼠心肌組織中miR-376b-5p表達

如圖 1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中 miR-376b-5p mRNA 表達顯著升高（ P ＜ 0.05 ）；與模型組比較，丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組心肌組織中 miR-376b-5p mRNA 表達水平顯著降低（ P ＜ 0.05 ），且 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組 miR-376b-5p mRNA 表達量接近假手術組， miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組 miR-376b-5p mRNA 表達水平無顯著差異，表明丹蔘酮 II A 能夠顯著抑制 AMI 大鼠心肌組織中 miR-376b-5p mRNA 表達。

3.2 丹蔘酮IIA抑制AMI大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平和CK-MB、LDH活性

如圖 2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中 TNF-α 、 IL-1β 水平和 CK-MB 、 LDH 活性均顯著升高（ P ＜ 0.05 ）；與模型組比較，丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組血清中 TNF-α 、 IL-1β 水平和 CK-MB 、 LDH 活性均顯著降低（ P ＜ 0.05 ），且 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組接近假手術組， miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組以上指標無顯著差異。

3.3 丹蔘酮IIA改善AMI大鼠心肌組織形態變化

如圖 3 所示， HE 染色可見假手術組大鼠心肌組織形態正常，心肌細胞排列規則、整齊、細胞間隙小；模型組大鼠心肌組織中心肌細胞排列紊亂，心肌纖維斷裂、細胞間隙大；丹蔘酮 II A 組心肌組織的病理學變化得到了顯著改善； miR-376b-5p ＋丹蔘酮 II A 組心肌組織的病理改變較模型組並沒有明顯變化； miR-376b-5p 抑制劑＋丹蔘酮 II A 組心肌組織的病理改變接近假手術組，且較丹蔘酮 II A 組的改善效果更佳，表明丹蔘酮 II A 能夠抑制 AMI 大鼠心肌組織的病理改變。

Masson 染色可見，假手術組大鼠心肌組織未見膠原纖維增多；模型組大鼠心肌組織有明顯的膠原纖維增生、沉積；丹蔘酮 II A 組心肌組織膠原沉積明顯減少，顯示出丹蔘酮 II A 對 AMI 大鼠心肌組織的保護作用。 miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組心肌組織膠原纖維沉積較模型組無明顯變化； miR-376b-5p 抑制劑＋丹蔘酮 II A 組心肌組織膠原纖維沉積接近假手術組，且較丹蔘酮 II A 組的改善效果更佳，表明丹蔘酮 II A 能夠抑制 AMI 大鼠心肌組織膠原纖維沉積形成。

3.4 丹蔘酮IIA降低AMI大鼠心肌組織Col1、Col3和α-SMA蛋白表達

如圖 4 所示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中 Col1 、 Col3 和 α-SMA 蛋白表達均顯著升高（ P ＜ 0.05 ）；與模型組比較，丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組心肌組織中 Col1 、 Col3 和 α-SMA 蛋白表達均顯著降低（ P ＜ 0.05 ），且 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組接近假手術組， miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組以上蛋白表達無顯著差異。

3.5 丹蔘酮IIA調控AMI大鼠心肌組織中TGF-β1/SMAD和RhoA/ROCK信號通路相關蛋白表達

如圖 5 所示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中 TGF-β1 、 p-Smad2/3 、 RhoA 、 ROCK1 、 ROCK2 和 FN 蛋白表達水平均顯著升高（ P ＜ 0.05 ）， Smad7 蛋白表達水平顯著降低（ P ＜ 0.05 ）；與模型組比較，丹蔘酮 II A 組和 miR-376b-5p inhibitor ＋丹蔘酮 II A 組心肌組織中 TGF-β1 、 p-Smad2/3 、 RhoA 、 ROCK1 、 ROCK2 和 FN 蛋白表達水平均顯著降低（ P ＜ 0.05 ）， Smad7 蛋白表達水平顯著升高（ P ＜ 0.05 ）， miR-376b-5p mimics ＋丹蔘酮 II A 組以上蛋白表達無顯著差異。

4 討論

AMI 是一種嚴重的冠狀動脈心臟病，每年死亡人數約佔全球死亡人數的1/3 ；而心室重構是AMI 基本病理過程，會造成大量心肌細胞纖維化，導致心臟功能障礙，最終導致患者死亡[19-20] 。研究表明，丹蔘酮 II A 能夠可降低心肌細胞凋亡，逆轉AMI 心肌細胞損傷[21-22] 。本研究發現，丹蔘酮 II A 能夠改善AMI 模型大鼠心肌組織病理形態，減輕心肌組織纖維化程度的發生。心肌細胞凋亡和纖維化是心室重構的一種重要病理改變，表明丹蔘酮 II A 可以改善心肌纖維化和心肌損傷進而抑制心室重構。然而，當同時給予AMI 模型大鼠miR-376b-5p 抑制劑時，AMI 模型大鼠心肌組織miR-376b-5p 表達顯著降低，心肌細胞凋亡和纖維化程度明顯改善，表明丹蔘酮 II A 與miR-376b-5p 抑制劑聯合應用能夠明顯改善AMI 模型大鼠心肌組織病理性改變。

在炎症反應中， IL-1β 和 TNF-α 等炎性細胞因子是啓動級聯炎症反應的關鍵因素。細胞釋放 IL-1β 和 TNF-α 能誘發心肌細胞活力下降和凋亡，加速心肌組織分泌大量膠原蛋白和心肌纖維化，損傷心肌功能，誘發 CK-MB 和 LDH 的過表達， CK-MB 和 LDH 是心肌損傷的重要標誌物，進而造成心室重構等 [23-25] 。研究表明， miRNA 參與心室重構的發生發展過程。本課題組前期已經發現 miR-376b-5p 在逆轉老年自發性高血壓大鼠左室重構中發揮重要作用。本研究發現，丹蔘酮 II A 能夠調節 AMI 模型大鼠心肌組織 miR-376b-5p 的表達，並能夠改善心肌組織細胞的形態，抑制 AMI 模型大鼠血清中 IL-1β 、 TNF-α 水平及 CK-MB 、 LDH 活力，減少心肌組織 Col 、 Col3 和 α-SMA 蛋白表達。然而，當同時給予 AMI 模型大鼠 miR-376b-5p 抑制劑時， AMI 模型大鼠的炎症因子、心肌損傷標誌物、膠原蛋白和 α-SMA 蛋白表達同時降低，表明丹蔘酮 II A 與 miR-376b-5p 抑制劑具有類似效果。

在心室重構的生理過程和病理過程中， TGF-β1/Smad 信號通路都發揮着重要作用 [26] 。 TGF-β1 能夠促進組織纖維化，加速組織損傷。研究表明， Smad7 是 TGF-β1/SMAD 信號通路的關鍵調節蛋白。 TGF-β1 的磷酸化能夠促進 Smad2/3 的磷酸化，進而抑制 SMAD7 參與心室重構 [27-28] 。同樣， RhoA/ROCK 信號通路也是調控肌動蛋白骨架的組裝、增殖、分化等過程的關鍵途徑。研究表明，心肌損傷後 RhoA 蛋白能夠介導機體 ROS 的產生，加速機體心肌細胞損傷的惡性循環，並能夠誘導核因子 -κB （ nuclear factor-κB ， NF-κB ）的活化，進一步激活 TGF-β1 、 IL-6 等炎症因子的分泌，又可加速 TGF-β1/Smad 信號通路的活化，加速惡性循環，導致大量炎症因子堆積 [29-30] 。本研究顯示，丹蔘酮 II A 能夠調節 AMI 大鼠心肌組織中 TGF-β1/Smad 和 RhoA/ROCK 2 條信號通路中相關蛋白的表達；當同時給予 AMI 模型大鼠 miR-376b-5p 抑制劑時， AMI 模型大鼠心肌組織中 TGF-β1/SMAD 信號通路和 RhoA/ROCK 信號通路相關蛋白表達與僅給予丹蔘酮 II A 結果一致。這表明丹蔘酮 II A 改善 AMI 可能是通過調節 miR-376b-5p 的表達，進而發揮作用的。

綜上，本研究聯合丹蔘酮 II A 和 miR-376b-5p 抑制劑治療發現，丹蔘酮 II A 和 miR-376b-5p 抑制劑具有類似效果，能夠抑制 miR-376b-5p 表達、心肌細胞損傷和纖維化，並能夠同時抑制機體炎症、 TGF-β1/Smad 和 RhoA/ROCK 信號通路活化，進而改善心室重構。丹蔘酮 II A 可能通過調節 miR-376b-5p ，在改善心室重構過程中發揮重要作用。

利益衝突所有作者均聲明不存在利益衝突

參考文獻（略）

來 源：胡月華，陳 強，邢海生，陳麗珠，郭曉華，任星星．丹蔘酮IIA通過抑制miR-376b-5p降低急性心肌梗死大鼠致炎細胞因子分泌並減輕心肌損傷研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(12):3887-3894.

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