國自然「榜一」名不虛傳，竟然還能聯合鐵死亡這麼用
來源：好本子
血紅素加氧酶-1 的高表達水平促進巨噬細胞衍生的泡沫細胞中的鐵死亡並加劇斑塊不穩定性
圖源：Redox Biology
1、這項研究的目的是 探討參與斑塊進展的關鍵鐵死亡相關基因（FRG）及其潛在的分子機制。 通過生物信息學分析、單細胞測序和免疫組化等表明了巨噬細胞血紅素加氧酶-1（HMOX1）是參與斑塊不穩定的關鍵 FRG；
2、這項研究的 創新之處 在於：①發現鐵死亡在 MDFCs（巨噬細胞衍生的泡沫細胞）的細胞毒性中起關鍵作用，並且是由缺氧應激介導的，Hmox1 的高表達水平誘導 MDFCs 鐵死亡並加劇斑塊不穩定；②探究了誘導巨噬細胞鐵死亡的潛在機制：在缺氧下由於 Egln3 降解而導致的 Hif1a 穩定激活了 MDFCs 中 Hmox1 的轉錄，隨後驅動鐵死亡。
研究背景
斑塊破裂伴隨血栓形成是急性心血管事件的主要原因，在此期間，巨噬細胞死亡是一個標誌。鐵死亡是早期和晚期動脈粥樣硬化之間的關鍵中間環節。現有證據表明巨噬細胞鐵死亡與斑塊脆弱性有關; 然而，確切的機制仍然難以捉摸。
研究思路
研究結果
1. 鑑定巨噬細胞 HMOX1 是斑塊失穩的關鍵 FRG
爲探索斑塊進展的潛在機制，研究者們通過 GSE163154 和 GSE28829 數據集分析了穩定斑塊和不穩定斑塊之間的差異生物學特徵。從 GSE163154 中鑑定出的 DEGs 主要參與了炎症反應，並激活了鐵死亡途徑。同樣，在易損斑塊中觀察到更大的免疫浸潤。進一步的單細胞測序分析顯示，HMOX1 主要在巨噬細胞中表達。免疫組化染色也證實了在不穩定斑塊的巨噬細胞豐富區，HMOX1 的表達增加，並伴有斑塊破裂，脂質沉積增加，膠原體積增加。基於上述研究結果，假設低氧應激可以誘導亞鐵細胞 HMOX1 的表達，隨後激活巨噬細胞鐵死亡。
圖 1 巨噬細胞 Hmox1 是參與斑塊失穩定的關鍵 FRG 的鑑定
2. 缺氧可上調 MDFCs 中 Hmox1 的表達並激活鐵死亡
接下來通過 GSE16099 數據集進一步研究了缺氧對巨噬細胞的影響。在常氧組和缺氧組之間發現了 DEGs，在缺氧處理的巨噬細胞中，HMOX1 的表達顯著上調。GO 和 KEGG 的分析結果如圖 2A 所示。用 ox-LDL 處理 BMDMs，誘導 MDFCs，結果未能觀察到暴露於常氧或低氧條件下的巨噬細胞中 Hmox1 表達的差異。然而，在缺氧條件下，MDFCs 中 Hmox1 的表達水平顯著升高。此外，缺氧抑制了 MDFCs 的活力，但對巨噬細胞無顯著影響。爲驗證鐵死亡是否在缺氧介導的細胞死亡中發揮重要作用，研究者們用各種細胞死亡抑制劑治療 MDFCs。
研究結果顯示，細胞凋亡和壞死抑制劑沒有發揮保護作用，而抑制鐵死亡對缺氧介導的細胞失活有保護作用。如圖 2E 所示，缺氧導致 MDFCs 中 GSH/GSSG 比值顯著降低，同時鐵含量和脂質過氧化水平顯著增加，而這在巨噬細胞中沒有觀察到。上述研究結果表明，鐵死亡在 MDFCs 的細胞毒性中起着關鍵作用，並且是由缺氧應激介導的。
圖 2 缺氧促進 MDFCs 中 Hmox1 的表達並驅動鐵死亡細胞
3. 高水平的 Hmox1 可促進 MDFC 的鐵死亡，並加劇斑塊的不穩定
用 Hmox1 過表達載體（oeHmox1）轉導的 MDFCs 顯示 Hmox1 表達顯著增加，Gpx4 表達降低。高水平的 Hmox1 誘導鐵死亡細胞死亡，其特徵是 ROS 過量產生、鐵保留增加和脂質過氧化。此外，由於 HMOX1 與免疫浸潤呈正相關，研究者旨在識別相關基因，並探討其潛在的機制，GSE163154 和 GSE28829 中上調和下調的前 20 個基因如圖 3D 所示。熱圖強調了 C-C 基序趨化因子配體（CCLs）和基質金屬蛋白酶（MMPs）的重要性。
相關分析顯示，HMOX1 與 ccl 和 MMPs 呈正相關，Hmox1 過表達促進了 Ccl3、Ccl4、Ccl19 和 Mmp9 的產生。爲了研究過量的 Hmox1 水平是否對斑塊穩定性有害，研究者們使用高劑量的 AAV2/9-F480-m-Hmox1-ZsGreen3 餵養 ApoE-/-小鼠。動物實驗結果顯示，與對照組（AAV-Con）相比，Hmox1 的高表達加重了頭臂動脈的斑塊負擔。雖然兩組間膠原體積無顯著性差異，但 AAV-Hmox1 組的斑塊病變表現爲易破裂的特徵，脂質沉積增加。
圖 3 Hmox1 過表達導致鐵死亡細胞死亡，並加劇斑塊的不穩定性
4. Hif1a 在 Egln3 降解條件下的穩定促進了 Hmox1 的轉錄
接下來對暴露於缺氧的 MDFCs 中進行了 RNA-seq，並將 Egln3 鑑定爲候選基因。GSEA 一致顯示，在缺氧處理的 MDFCs 中，HIF-1 信號通路和鐵死亡通路被激活。Western 結果顯示缺氧條件下 Egln3 表達降低，Hif1a 和 Hmox1 活性增加。同樣，Egln3 沉默通過誘導鐵死亡促進細胞內 Hif1a 的積累，並上調 Hmox1 的表達。爲了瞭解 HIF1A 影響 HMOX1 表達的機制，用 HIF1A pcDNA3.1 和 HMOX1 啓動子-報告基因質粒共轉染 293T 細胞。
結果表明，HIF1A 增強了 2000 bp、1500 bp、1300 bp、1000 bp 和 100 bp 啓動子的活性，表明 HIF1A 的結合位點可能位於 HMOX1 啓動子區域的 100 bp 範圍內。該結合位點的突變顯着抑制了 HIF1A 激活的熒光素酶活性。Hif1a 與 Hmox1 啓動子的直接結合也通過 ChIP 分析驗證了。
圖 4 缺氧誘導因子（Hif）1a 在 Egln3 降解條件下的穩定促進了 Hmox1 的轉錄
文章小結
總之，這項研究結果表明了：①Hmox1 的作用是水平依賴性的，Hmox1 的過度藥理學誘導會驅動 MDFCs 中的鐵死亡氧化應激；②缺氧條件誘導 MDFCs 中的 Hmox1 過表達，這加劇了鐵死亡細胞死亡並影響了斑塊穩定性；③Egln3 降解介導的 Hif1a 穩定化增加了 Hmox1 活性；④高 Hmox1 表達水平對 MDFCs 活力和噬菌斑穩定性有害，爲動脈粥樣硬化的管理提供了參考。
本文及圖片來源於好本子，作者轉載