J. Future Foods | 刺五加苷E抑制腫瘤靶點及作用機制

Introduction

刺五加（Acanthopanax senticosus, AS）是東北常見的多年生落葉灌木。莖和果可製成AS酒和飲料，果實可榨油製成肥皂，嫩莖和葉是受歡迎的山菜，其他的葉可油炸加工成AS茶。此外，AS是一種常見的中藥。AS已被用於治療許多不同種類的疾病，包括風溼病、糖尿病和肝炎。此外，AS的抗腫瘤作用也得到了證實。AS含有多種化合物，如多糖、刺五加苷E (Eleutheroside E, EE)、皁苷B、槲皮素、金絲桃苷、異嗪地丁等。這些化合物已被成功地分離出來，並對其功能進行了研究。AS多糖、槲皮素和異沙比利丁已被證明可以抑制腫瘤的發展。目前的研究已經證實，EE通過增加胰島素抵抗來調節糖代謝，改善小鼠的認知功能障礙。此外，EE還具有抗疲勞、抗氧化、免疫調節等作用。然而，EE的抗腫瘤活性尚未見報道。

一些研究證實，具有木質素結構的化合物具有抗癌、抗氧化和抗炎活性。Procumbenoside A, Justicidin A, Diphyllin, Tuberculatin是從原菇中提取的具有木質素結構的化合物，對Hep3B細胞具有較強的細胞毒性，並能抑制腫瘤壞死因子-α的產生。木質素結構化合物包括Machilin A, (−)-Sesamin C, Machilin G, (+)-Galbacin等，均具有抑制肺癌、結腸癌和乳腺癌增殖的作用。此外，也證實了磷脂酶Cγ1 (PLCγ1)是這些化合物在癌細胞中的靶標。從川芎中提取的一些呋喃木脂素結構化合物對肝癌細胞和宮頸癌HeLa細胞也有抑制作用。

作爲一種具有木質素結構的化合物，EE的抗腫瘤活性有待進一步研究。以前的研究提出，它可能有抑制癌症的潛力，但沒有進一步的證據。爲了評價EE的抑癌能力和具體的抑癌機制，哈爾濱工業大學的Deyong Zeng、Yingchun Zhang*和Weihong Lu*等利用Swiss Target Prediction數據庫、string數據庫、DAVID數據庫和TCGA數據庫以及生存分析來證明EE的抑癌潛力。進一步確定其作用靶點和作用機制，並利用體外細胞實驗進行驗證。本研究首次爲EE抑制腫瘤的可能性提供了理論依據。

Results and discussion

EE靶蛋白和靶蛋白相互作用

化學品與蛋白質和基因相互作用，在體內細胞和器官水平發揮其生理功能。基於這一理論，本研究使用瑞士靶標預測數據庫預測EE的靶蛋白。在這項研究中，預測共有10 個受EE直接影響的靶蛋白（表1）。它們分爲5 類，包括銀蛋白偶聯受體家族、胞漿蛋白、氧化還原酶、磷酸酶和轉錄因子。使用字符串數據庫進行擴展和分析，共有414 種蛋白質，包括10個直接作用的靶蛋白，被確定與EE相關。

表1 與EE相互作用的蛋白質

爲了評估EE介導的人體生物學功能，使用DAVID數據庫進一步分析了目標蛋白。在DAVID數據庫中，選擇GAD\U DISEASE\U CLASS對目標蛋白的生物學功能進行初步評估（表2）。靶蛋白在癌症、藥物基因組學、免疫、神經、心理、代謝和心血管疾病中顯著富集。大多數蛋白質（238）在癌症中富集，表明EE可能在抑制腫瘤中發揮重要作用。

表2 靶蛋白作用的主要疾病

爲了闡明EE在腫瘤抑制中的作用，搜索了GAD\U疾病定位靶蛋白的特定癌症類型。結果表明，靶蛋白主要分佈在乳腺癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌中（圖1）。這表明EE可能在這幾種腫瘤細胞的抑制中發揮重要作用。

圖1 靶蛋白在不同類型癌症中的分佈

4 種不同類型癌症中的DEG

圖2結果表明，BLCA共有3 924 個DEG，其中2 868 個上調DEG和1 056 個下調DEG（圖2A）；LUAD的DEG爲5 872，上調5 098，下調774（圖2B），BLCA的DEG爲3 587，上調2 442，下調1 145（圖2C），PRAD的DEG爲1 360，上調807，下調553（圖2D）。

圖2 BRCA（A）、LUAD（B）、BLCA（C）、PRAD（D）中DEGs的鑑定

交叉基因的鑑定

爲了尋找EE抑制腫瘤的潛在靶點，考慮了4 種癌症中TGPs（與EE相互作用的蛋白質）和DEGs的交叉點。根據結果（圖3），胰島素和載脂蛋白A-II（ApoA II）存在於5 個部分中。胰島素是一種合成代謝激素，協調體內葡萄糖的氧化或儲存，調節全身代謝。目前的研究表明，高胰島素血癥與多種癌症的發生有關，包括乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、肝癌、食管癌、腎癌和胰腺癌。載脂蛋白aⅡ是高密度脂蛋白（HDL）的組成部分，在指導HDL脂質代謝的命運中起着重要作用。血清載脂蛋白a II被發現可以降低癌症患者的病情，是一種潛在的診斷生物標誌物。

圖3 TGPs和DEGs的交叉情況

功能補充

對所有共享基因進行KEGG功能富集。根據結果，一些癌症相關途徑顯著豐富（P<0.05，表3），包括癌症途徑（hsa05200）、脂肪細胞因子信號途徑（hsa04920）、hif-1信號途徑（hsa04066）、AMPK信號途徑（hsa04152）、FoxO信號途徑（hsa04068）、糖酵解/糖異生（hsa00010）、Rap1信號途徑（hsa04015）、胰島素分泌（hsa04911），前列腺癌（hsa05215）、cGMP-PKG信號通路（hsa04022）、GnRH信號通路（hsa04912）、PI3K-Akt信號通路（hsa04151）、TRP通道的炎症介質調節（hsa04750）、胰島素抵抗（hsa04931）。大多數重要途徑與腫瘤的增殖和轉移有關，這表明EE可能主要通過影響增殖和轉移來影響腫瘤的進展。

表3 KEGG富集常見基因（P<0.05）

在BLCA、BRCA和LUAD中，葡萄糖代謝相關過程（GO:0045721、0042593）、DNA複製的正調節（GO:004574）和MAPK級聯的正調節（GO:0043410）顯著豐富（圖4A-4C），表明EE可能通過糖代謝影響這3 種癌症。DNA的加速複製會損害癌細胞，DNA複製的正調控可能是EE影響這三種癌症的因素之一。此外，細胞增殖過程（GO:00016666、0008284、0001525）在BRCA中顯著富集（圖4B），表明EE可能影響BRCA的增殖過程。在PRAD中，脂質代謝過程（GO:0050995，0006656）和糖代謝過程（GO:0015758，0006006）顯著豐富。

圖4 共有基因GO功能富集分析

4 種癌症共有的基因的序列分析

爲了探索共享基因之間的相互作用，使用STRING（所需的最小相互作用分數）進行了網絡分析 = 0.4），並通過Cytoscape 3.5可視化網絡（圖5）。在BLCA中，PPI網絡有26 個節點和43 個邊緣，平均節點度爲3.31（P<0.001，圖5A）。在BRCA中，PPI網絡有34 個節點和71 個邊緣，平均節點度爲4.18（P<0.001，圖5B）。在LUAD中，PPI網絡有31 個節點和62 個邊緣，平均節點度爲4.13（P<0.001，圖5C）。在PRAD中，PPI網絡有5 個節點和5 條邊，平均節點度爲2（P = 0.011，圖5D）。在BLCA、BRCA和LUAD中，相互作用的共享基因可分爲信號轉導、基礎代謝（胰島素、脂質）和細胞週期三個功能簇。在BLCA中（圖5A），INS、IL6、JUN、CDK1、ADCY5和PENK是連接這3 個功能集羣的關鍵節點。在BRCA中（圖5B），CDK1、INS、IL6、NPY是連接各種功能集羣的關鍵節點。在LUAD中（圖5C），INS、IL6、EGF、CDK1、NPY、ADCY8成爲連接3 個功能簇的關鍵節點。此外，在4 種癌症中，INS始終處於網絡的中心（圖5），這表明INS可能是EE影響癌症的關鍵部位。

圖5 建立4 種癌症共有的基因PPI網絡

Kaplan-Meier生存估計

在BLCA中，5 個靶基因的低表達組的存活率高於高表達組，這表明這些基因的上調錶達將加速BLCA的進展（圖6A-6E）。在BLCA中，高表達組（GRM8、PTK6和RAD51）的存活率低於低表達組，這也表明這些基因的上調可能加速BRCA的進展（圖6F-6H）。在LUAD中，在所有靶基因中，高表達組的存活率低於低表達組（圖6I–6Q）。雖然僅將ADCY8確定爲PRAD中可能的靶基因，但高表達組的存活率高於低表達組（圖6R），這也意味着可以通過增加ADCY8的表達來改善PRAD。

圖6 常見基因的Kaplan-Meier生存率估計

EE對BRCA的抑制作用

爲了進一步驗證實驗結果，使用MTT法探索EE對MDA-MB-231乳腺癌細胞存活率的影響（圖7）。結果表明，EE對MDA-MB-231乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，這種抑制作用具有一定的量效關係（圖7）。當EE濃度爲50和100 μg/mL時，MDA-MB-231乳腺癌細胞的存活率沒有顯著影響，但當EE濃度達到200 μg/mL時，MDA-MB-231乳腺癌細胞的存活率爲86.3%。當EE濃度繼續增加至400 μg/mL時，MDA-MB-231乳腺癌細胞的存活率僅爲72.67%（圖7）。這些結果表明，EE對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用。

圖7 EE對MDA-MB-231增殖的影響

EE處理對BRCA細胞靶基因表達的影響

使用400 μg/mL濃度的EE抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞。培養48 h後，用qRT-PCR檢測17 個預測靶基因的相對錶達。令人驚訝的是，EE幾乎下調了所有靶基因的表達（圖8）。這與Kaplan-Meier生存率估計值一致（圖6F-6H）。EE作用後，GRM8、PTK6和RAD51的表達分別下調33%、36%和38%。

圖8 熱圖描述了用400 μg/mL EE抑制的MDA-MB-231乳腺癌細胞中17 個預測靶基因的相對錶達

Conclusion

本研究提出了一個關於EE抑制癌症的靶點和機制的假設。ADCY2、ADCY5、JUN、LRRK2和PENK被認爲是EE抑制BLCA的靶點。EE可降低其表達，激活mTOR和STAT3信號，抑制BLCA。EE通過下調GRM8、PTK6、RAD51的表達，激活STAT3/5、FAK、p130Cas、BKS、ERK/MAPK和PI3K/AKT等信號通路，抑制BRCA。對於LUAD，EE通過抑制DNA修復相關基因的表達來抑制癌細胞的增殖和轉移。ADCY8被認爲是EE抑制PRAD的靶點。EE上調ADCY8的表達，激活cAMP信號通路，達到抑制PRAD的作用。體外細胞實驗表明，EE對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，qRT-PCR結果也表明了我們預測結果的準確性。

Identification of targets and mechanisms for Eleutheroside E in the treatment of cancer

Deyong Zenga,b,c,1, Yi Xionga,b,1, Yishu Yina,b, Shan Shana,b, Fangyuan Duana,b, Xin Gaoa,b, Chen Songa,b, Mengyao Liua,b, Yingchun Zhanga,b,*, Weihong Lua,b,c,*

a School of Medicine and Health, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China

b National and Local Joint Engineering Laboratory for Synthesis, Transformation and Separation of Extreme Environmental Nutrients, Harbin 150001, China

c Chongqing Research Institute, Harbin Institute of Technology, Chongqing 401135, China

*Corresponding author.

E-mail address: zyc229@163.com; lwh@hit.edu.cn

Abstract

Eleutheroside E (EE) is a monomer compound isolated from Acanthopanax senticosus, which has functions of antifatigue, antioxidation, and immune regulation. However, the function of EE in inhibiting cancer has rarely been reported. In this study, we used bioinformatics to determine the role and mechanisms of EE in inhibiting breast cancer (BRCA), prostate cancer (PRAD), lung cancer (LUAD), and bladder cancer (BLCA). Finally, the MTT method was used to evaluate the inhibitory effect of EE on breast cancer MDA-MB-231 cells, and the target genes were determined by qRT-PCR. The results showed that the survival rate of MDA-MB-231 cells was reduced by 27.33% after 400 μg/mL EE treatment. The results of qRT-PCR showed that EE down-regulated target genes in breast cancer cells, which was consistent with our predicted results. Moreover, our results indicated that EE may have impact on the transcription and translation of BLCA cells by targeting ADCY2, ADCY5 and JUN. In BRCA, we identified three targets for EE. In addition, EE affected DNA repair and the development of BRCA by affecting the expression of RAD51. In LUAD, we identified 9 targets for EE, 8 of which were related to DNA repair. EE inhibited PRAD by targeting ADCY8. Our research was the first report on the targets and mechanisms of EE for suppressing cancer combined with clinical data. Our research also provides theoretical support for using EE to suppress cancer.

Reference:

ZENG D Y, XIONG Y, YIN Y S, et al. Identification of targets and mechanisms for Eleutheroside E in the treatment of cancer[J]. Journal of Future Foods, 2022, 2(1): 68-81. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.03.019.

翻譯/編輯：王佳紅；責任編輯：張睿梅

封面圖片來源：圖蟲創意