納米抗體的發現及結構特點

摘要

納米抗體是在駱駝科及鯊魚科動物血清中大量存在的一種天然抗體，與常規單克隆抗體相比，納米抗體缺失輕鏈，其重鏈可變區VHH的CDR3區較長，是目前已知的可結合抗原的最小單位。特殊的結構特徵和性質賦予了其一些其它常規抗體或抗體片段所不具有的特性。本文講從納米抗體的發現，結構特點，生化特性及藥物研發現狀四個方面做一簡要概述。

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納米抗體的發現

近年來，隨着抗體藥物不斷應用於更多治療領域，抗體藥物的治療機理變得更爲複雜，同時抗體藥物的結構也變得更爲多樣化。納米抗體（nanobodies，Nbs）因具有較小的相對分子質量，其獨特的分子結構使其適用於疾病診斷治療等諸多領域，當前得到了廣泛的關注。納米抗體的發現是在上世紀80年代，比利時布魯塞爾自由大學的免疫學教授Hamers遇到了兩個大學生向他抱怨學校安排的實驗課程結果都是已知的，沒有挑戰性。於是Hamers教授將冰箱中剩餘的半升用於研究昏睡病的駱駝血讓學生Muyldermans等人嘗試從中提純駱駝的抗體。Muyldermans等人驚奇地發現，從駱駝血液中提純的抗體中有一部分不屬於所有脊椎動物的標準類型，而是一種完全新型的、更簡單的變種抗體，這樣的結果讓所有人都很疑惑。Hamers立刻成立了研究小組對這種抗體進行專門研究，至此，駱駝抗體就從一個學生的實驗迅速演變爲Hamers和同事研究的主要項目。1993年，Hamers等首次在《自然》雜誌中報道，在駱駝科及鯊魚科動物血清中大量存在一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HcAb）。與常規單克隆抗體相比，除了缺少輕鏈外，其重鏈可變區與鉸鏈區之間沒有CH1區，只含有一個重鏈可變區（VHH）和兩個常規的CH2與CH3區（圖1）。重鏈抗體的VHH片段與常規抗體的VH特徵不同，但單獨克隆並表達出來的VHH結構具有與原重鏈抗體相當的結構穩定性以及與抗原的結合活性，是目前已知的可結合目標抗原的最小單位。結構解析結果表明：VHH晶體寬爲2.5nm，長4.8nm，分子量只有約15KDa，因此也被稱作納米抗體（Nanobody）。

圖1 不同形式抗體示意圖

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納米抗體的結構特點

與常規單克隆抗體的VH摺疊結構相似，納米抗體的晶體和水溶性結構兩個β片層組成支架。VHH的CDR3區較長，人和小鼠抗體VH的CDR3區平均長度爲9-12個氨基酸，VHH的CDR3區爲16-18個氨基酸。可變區的擴大能夠形成更豐富的抗原結合構象，在一定程度上彌補了輕鏈缺失導致結合力下降的不足，從而使得納米抗體本身具有較強的抗原結合能力。納米抗體的CDR3區可形成一個特殊的凸環，凸環大部分摺疊在FR2上，這裡疏水殘基受到保護，可避免與外界水環境接觸。凸環中的半胱氨酸與CDR1（或FR2）區的半胱氨酸形成二硫鍵從而使其結構穩定。該凸環結構能夠結合酶的裂隙或是凹穴，因此能夠很好的成爲酶的抑制劑、受體的激動劑或拮抗劑。

在常規單克隆抗體VH的FR2區，有四個氨基酸參與了與VL的相互作用，這四個氨基酸分別爲V37、G44、L45、W47。而在納米抗體VHH中，這四個氨基酸發生了突變，分別爲F（Y）37、E44、R45、G47。這四個位點的變化不但使VHH保持了較好的特異性和親和性，還使其具有高親水性，從而能夠保持穩定的結構（如圖2所示）。

納米抗體VHH基因由VH家族的亞族III進化而來，其豐富的基因序列多樣性使得重鏈抗體可形成大量不同結構形式的凸環。人類VH3與駱駝VHH胚系基因具有高度的同源性，因此只需對VHH基因進行較少的改變即可實現抗體人源化，通過基因工程技術獲得高親和力、高特異性、高穩定性的納米抗體。

圖2 VH和VHH 比較

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納米抗體的生化特性

（1）免疫原性弱。免疫原性與分子量及化學結構等有關，分子量越小免疫原性越小。由於納米抗體的分子量只有常規抗體的1/10，只有一個結構域，因此刺激機體形成特異性抗體或是引起體液和細胞免疫應答機率大大降低。同時，納米抗體無Fc段，避免了Fc引起的補體反應，對人體免疫原性很低，與人的生物相容性較好。但也有研究表明納米抗體作爲藥物長期反覆使用會增加免疫原性，影響治療。無論如何，相比於傳統抗體，納米抗體在免疫原性方面表現的更弱。

（2）可溶性高、耐受性強。納米抗體的FR2中四個位點的突變，使自身的溶解性增加，成藥性更好。納米抗體內部的二硫鍵使其抗熱性和耐酸鹼能力變得極強。常規單克隆抗體穩定性差，容易出現聚集現象，併發生不可逆的熱聚合。而納米抗體在高溫環境中長期放置仍然具有生物活性，並且在強變性劑條件下也表現出較高的耐受性。

（3）組織滲透性強。僅有15kD的納米抗體能夠穿透血腦屏障，爲大腦中疾病的研究及治療提供新的方法。納米抗體能夠很容易從腎小球濾過，導致其很快從血清中被清除，半衰期變短。高滲透性的納米抗體可進入緻密的組織，而多餘未結合的納米抗體很快被清除，這有利於疾病的診斷。此外，納米抗體也適合作爲胞內抗體靶向胞內乃至核內蛋白。一種特殊的胞內抗體Chromobody，結構爲納米抗體與熒光蛋白融合，可以用於監測胞內生化過程。

（4）表達高效、純化簡單。納米抗體結構簡單，適合於原核和各種真核表達系統進行高效表達。重組納米抗體通常在E. coli中的表達量爲5-10 mg/L。在酵母和真菌中產量更高，從1 L振盪培養的酵母菌中培養基能產出100 mg蛋白。納米抗體研發巨頭Ablynx公司（已被賽諾菲收購）利用酵母反應器釀造納米抗體的產量可達到0.5g/L。不同抗體由於其序列差異表達產量的差異也較大。其特點表現爲：A. 當VHH與常規VH相似時，VHH的表達量在酵母中的表達量會下降；B. 當VHH的C端形成二硫鍵時，VHH的表達量會下降；C. 含有N端糖基化位點的序列，在酵母中的表達量會顯著提高。納米抗體生產價格相對低廉，可大規模生產用於開發治療性抗體藥物、診斷試劑、親和純化基質和科學研究等領域。

納米抗體可用多種方式進行純化，並且純化工藝簡單方便。利用酵母培養物上清液純化的納米抗體純度可達到80-90%。細菌提取物通過簡單的滲透壓衝擊，純化的納米抗體的純度能夠滿足酶聯免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和蛋白質印跡法的使用標準。利用C末端His6-tag通過Ni-NTA柱提純，可以獲得純度將近80%的納米抗體。如果需要進一步純化，則可以通過離子交換或凝膠過濾層析等方法，可以大大提高純度。

（5）改造容易。納米抗體通常是經過基因工程的方法從駱駝血液中克隆出VHH基因，再利用原核或真核細胞進行表達獲得。因此，人們容易對現有的納米抗體進行修飾或對相應的VHH基因進行改造。納米抗體是理想的多價和多特異性抗體的構建單元，可通過短小的鏈接序列（linker）聚合在一起轉換成多價或多特異的形式。多價抗體比單價抗體具有更高的抗原親和力，多特異性抗體比單價抗體具有更高的抗原識別能力。此外，由於是單域抗體，能夠很容易與其他分子偶聯，如連接放射性同位素、連接毒素製備Immunotoxin等；或是通過基因工程技術與其他結構形成新的融合分子，如能延長半衰期的物質酶、抗菌肽或是顯影物等

納米抗體作爲一種嚴格的完整單體，其特殊的結構特徵和性質賦予了其一些其它常規抗體或抗體片段所不具有的特性。但是納米抗體的臨牀安全性問題，主要包括駝源的Nb在人體內是否會產生免疫應答，以及腎小球濾過導致載體核素或藥物誘發腎臟毒性等問題，關係到能否大規模用於腫瘤的診斷與治療。

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納米抗體研發現狀

當前，首個納米抗體藥物Caplacizumab，由Ablynx（該公司於2018年1月被賽諾菲收購）研發，已於2018年8月31日獲歐洲藥物管理局（EMA）批准上市，後於2019年2月6日獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批准上市，商品名爲Cablivi?。用於治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）的成人患者。由於市場上並無該疾病的治療藥物，caplacizumab成爲同類第一的藥物，2009年獲得孤兒藥資格。除此，還有多個納米抗體進入到臨牀研究階段。分佈在腫瘤、神經系統疾病、感染性疾病、皮膚病、免疫系統疾病等多種疾病領域。但有部分藥物已暫停或停止開發。

相比於傳統抗體，納米抗體克服了開發週期長，穩定性較低，保存條件苛刻等缺陷，逐漸成爲新一代治療性生物醫藥與臨牀診斷試劑中的新興力量。

參考資料：

1.Hamers-Casterman, C., T. Atarhouch, S. Muyldermans, G. Robinson, C. Hamers, E. B. Songa, N. Bendahman, and R. Hamers. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363:446-448.

2.Muyldermans, S., T. N. Baral, V. C. Retamozzo, P. De Baetselier, E. De Genst, J. Kinne, H. Leonhardt, S. Magez, V. K. Nguyen, H. Revets, U. Rothbauer, B. Stijlemans, S. Tillib, U. Wernery, L. Wyns, G. Hassanzadeh-Ghassabeh, and D. Saerens. 2009. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet Immunol Immunopathol 128:178-183.

3.HARMSEN M M, RUULS R C, NIJMAN I J, et al. Llama heavychain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features[J]. Mol Immunol, 2000, 37(10):579-590. DOI:10.1016/s0161-5890(00)00081-x.

4.https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/cablivi-epar-product-information_en.pdf