突破/陳列平課題組揭示免疫學老兵CD8a的新角色

2019的拉斯克基礎醫學獎（2019 Albert Lasker Basic Medical Research Award）頒給了Max Cooper和Jacques Miller教授，獎勵他們分別發現免疫系統的B細胞和T 細胞。

1961～1962年，Jacques Miller 教授用他自學的嬰兒胸腺（Thymus）切除術首次證明了胸腺器官不是當時醫學界認爲的可有可無的多餘器官，如果嬰兒小鼠胸腺被手術切除，成年後的小鼠外周淋巴器官體積大大減小【1】， 而且缺少負責免疫排斥的殺傷性細胞【2】。Jacques Miller 被免疫學界公認爲是T （Thymus 的第一個字母）細胞的發現者。Jacques Miller 教授在後續的工作也發現胸腺來源的T細胞既具有殺傷性功能也具有幫助B細胞產生抗體的功能。但他並沒有進一步深究哪一羣T細胞具有殺傷性，哪一羣T細胞具有幫助性。

1975年，Herbert Oettgen，Lloyd Old，Edward Boyse, 和Havey Cantor四位教授揭示CD8a+CD8b+ （又叫Ly2+Ly3+）的T細胞具有殺傷性功能，而CD4+ (又叫Ly1+) 的T 細胞具有幫助B細胞抗體反應和幫助殺傷性T細胞的功能【3-6】。從此，CD8a或者CD8b 被認爲是殺傷性T細胞的標記分子，而CD4被認爲是幫助性T細胞的標記分子。

1988年，Dan Littman 教授證實CD8a分子的胞外區可以結合MHC-I【7】。同年，Joseph Bolen 教授發現CD8a分子的胞內區可以結合Lck【8】。於是，CD8a 分子不僅是一個標記分子，免疫學界認爲CD8a分子可以作爲TCR的共受體而增強CD8+ T 細胞的反應。很多體外實驗支持CD8a分子的共受體假說，但是缺乏體內實驗的直接支持。CD8a分子在體內的功能有待闡明。

1991 年， Tak Mak 教授試圖研究CD8a分子在體內的功能，於是設計出CD8a 基因敲除小鼠，發現CD8a基因對殺傷性T細胞在胸腺中的發育和陽性選擇非常關鍵，殺傷性T細胞無法在CD8a–/– 小鼠胸腺中完成正常發育和陽性選擇，導致CD8a–/– 小鼠外周淋巴器官中沒有殺傷性T細胞【9】。於是CD8a基因在體內胸腺發育中的功能被闡明。但是外周淋巴器官中殺傷性CD8+ T細胞上CD8a蛋白的功能一直懸而未決，沒有得到直接的體內試驗闡明。

2022年，耶魯大學癌症免疫中心主任，美國國家科學院院士，陳列平教授課題組在Science發表論文闡明瞭外周淋巴器官中殺傷性CD8+ T細胞上CD8a蛋白在體內的功能【10】。

該課題組運用CRISPR-Cas9技術設計出藥物（tamoxifen）誘導型的條件性CD8a基因敲除小鼠。在沒有藥物（tamoxifen）誘導的條件下，該條件性CD8a基因敲除小鼠和野生型正常小鼠沒有區別，殺傷性CD8+ T細胞在胸腺可以正常的發育和陽性選擇，外周淋巴器官中充滿殺傷性CD8+ T細胞。接下來，該課題組從條件性CD8a基因敲除小鼠的外周淋巴器官中分離出CD8+ T細胞，然後過繼性轉移到野生型小鼠中，藥物（tamoxifen）注射受體小鼠會特異性敲除過繼轉移的CD8+ T細胞上的CD8a 基因。利用這一系統，可以特異性的研究CD8a基因在體內殺傷性CD8+ T細胞上的功能。他們的研究發現，藥物誘導條件性敲除外周殺傷性CD8+ T 細胞上的CD8a會激活幼稚型或者記憶型殺傷性CD8+ T細胞，同時減少幼稚型或者記憶型CD8+ T細胞的存活，進一步的研究表明CD8a缺失引起的T細胞減少可能是T細胞活化引起的細胞程序性凋亡。值得一提的是，作者檢查了TCR信號通路下游分子，發現CD8–/– T細胞的TCR信號減弱，所以CD8a缺失引起的細胞活化並不是TCR通路介導的。

爲了證實藥物誘導型CD8a基因敲除的發現，作者做出了CD8a的單克隆抗體，發現CD8a的單克隆抗體注射到小鼠中，也可以激活外周CD8+ T 細胞，爲了排除抗體Fc的depletion效果，作者測序出CD8a的單克隆抗體的序列，並用高壓注射的方法在小鼠體內表達CD8a的單克隆抗體的Fab片段，發現Fab片段也可以激活幼稚型和記憶型CD8+ T細胞和減少CD8+ T細胞的存活。

接下來，作者從含有大約6000種膜蛋白的蛋白庫中找到了人類CD8a蛋白的配體PILRa, 並且可以用流式和ELISA的方法確認，同時CD8a-PILRa的相互作用在小鼠中是保守的。作者發現CD8a的單克隆抗體或者Fab片段都可以阻斷CD8a-PILRa的相互作用，說明他們在體內的功能可能是由於阻斷了CD8a-PILRa的相互作用。

PILRa是高表達在髓系細胞上的膜蛋白，作者同時也做出了PILRa的單克隆抗體去阻斷CD8a-PILRa的相互作用。在小鼠體內注射PILRa的阻斷抗體，發現也可以激活幼稚型和記憶型CD8+ T細胞和減少CD8+ T細胞的存活。作者還利用CRISPR-Cas9技術生產了PILRa 基因敲除小鼠，發現年輕時的PILRa基因敲除小鼠外周幼稚型或者記憶型CD8+ T細胞沒有變化，但在年齡到達一年時，PILRa基因敲除小鼠的外週記憶型CD8+ T細胞顯著下降。作者假設可能是PILRa分子另外的受體中和了PILRa-CD8a的抑制性信號，導致PILRa基因敲除小鼠到一年時纔出現部分表型。

近二十年來，免疫學界對幼稚型和記憶型CD8+ T細胞在外周存活的詳細研究表明MHC-I 和IL-7 負責幼稚型CD8+ T細胞的存活信號，而記憶型CD8+ T細胞只需要IL-7和IL-15提供存活信號。該研究表明PILRa–CD8a通路介導的細胞穩態靜息也是幼稚型和記憶型CD8+ T細胞存活的重要機制。像很多原創性文章一樣，這篇文章闡明瞭很多問題，同時也開啓了很多新的問題。比如由於分泌性PILRa在小鼠血清中檢測不到，說明髓系細胞–CD8+ T細胞之間的細胞-細胞相互作用對於維持CD8+T細胞的穩態靜息很重要，這種髓系細胞– CD8+ T細胞的相互作用除了PILRa–CD8a通路以外，還有沒有其他的膜蛋白分子通路？又比如，該文發現CD8a缺失誘導的T細胞活化不是TCR通路提供信號，那麼是哪種通路在提供激活信號？回答這些新問題將進一步幫助我們理解認識T細胞。

陳列平院士爲該文通訊作者，鄭伶華博士爲該文第一作者。第一作者鄭伶華博士和第二作者韓雪博士已在俄亥俄州立大學Pelotonia 免疫癌症研究所成立兩個獨立實驗室, 將繼續圍繞 T 細胞的基礎免疫學和免疫治療（腫瘤免疫，自身免疫病）開展前沿探索，並重視臨牀轉化研究，歡迎博士生，博士後，訪問學生/學者加入。

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圖片

https://doi.org/10.1126/science.aaz8658

製版人：十一

參考文獻

1. Miller, J.F., Immunological Function of Thymus.Lancet, 1961. 2(720): p. 748-&.

2. Miller, J.F.A.P., Effect of Neonatal Thymtomy on Immunological Responsiveness of Mouse.Proceedings of the Royal Society Series B-Biological Sciences, 1962. 156(964): p. 415-+.

3. Kisielow, P., et al., Ly Antigens as Markers for Functionally Distinct Subpopulations of Thymus-Derived Lymphocytes of Mouse.Nature, 1975. 253(5488): p. 219-220.

4. Shiku, H., et al., Subpopulations of Cytotoxic T Cells with Different Surface Phenotypes.Proceedings of the American Association for Cancer Research, 1975. 16(Mar): p. 67-67.

5. Cantor, H. and E.A. Boyse, Functional Subclasses of T Lymphocytes Bearing Different Ly Antigens .1. Generation of Functionally Distinct T-Cell Subclasses Is a Differentiative Process Independent of Antigen.Journal of Experimental Medicine, 1975. 141(6): p. 1376-1389.

6. Cantor, H., et al., Characterization of Subpopulations of T-Lymphocytes .1. Separation and Functional Studies of Peripheral T-Cells Binding Different Amounts of Fluorescent Anti-Thy 1.2 (Theta) Antibody Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (Facs).Cellular Immunology, 1975. 15(1): p. 180-196.

7. Norment, A.M., et al., Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.Nature, 1988. 336(6194): p. 79-81.

8. Veillette, A., et al., The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck.Cell, 1988. 55(2): p. 301-8.

9. Fung-Leung, W.P., et al., CD8 is needed for development of cytotoxic T cells but not helper T cells.Cell, 1991. 65(3): p. 443-9.

10. Zheng, L., et al., The CD8alpha-PILRalpha interaction maintains CD8(+) T cell quiescence.Science, 2022. 376(6596): p. 996-1001.

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