詳解丨基因KO了，蛋白還殘留？

構建基因敲除（KO）細胞時，明明DNA測序已經產生了移碼的indel，但用Western Blot檢測蛋白還是不理想，到底是什麼問題呢？

圖1 敲除前後，WB條帶無差異

1. 首先考慮抗體特異性。

在評估基因過表達或干擾效果時，抗體能夠檢測到條帶差異即可，對於非特異性條帶的容忍度較高。然而，對於確認基因是否被完全敲除，非特異性條帶的問題變得尤爲關鍵。因此，採購抗體時注意查看該抗體是否經過KO驗證。

2. 覈查敲除方案可覆蓋的基因轉錄本情況。

通過NCBI、ensemble或UCSC等數據庫查看該基因轉錄本，覈對敲除方案是否完全覆蓋。如果有未覆蓋的情況，轉錄本產物和WB條帶是否能對應上？——儘可能採用片段敲除方案，覆蓋更多轉錄本，在產生非3倍數indel的同時破壞基因更大的片段。

3.覈查基因本底表達水平。

如果基因本底表達量很低，可能導致目標蛋白本身無法通過WB檢測到，而WB結果上的條帶均非目的條帶，無法分析敲除前後的變化情況，影響結果判斷。

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