疫苗前沿 | mRNA傳染病疫苗最新綜述

導讀：疫苗的接種是疾病控制、緩解的重要手段。然而，目前已獲許可的一些疫苗無法穩健誘導機體產生廣泛的保護以及持久的免疫反應，且生產困難、耗時，這凸顯了進一步改善疫苗的必要性。

mRNA疫苗是疫苗學領域新秀，目前研究已經解決了體外轉錄(In vitro-transcribed, IVT)的基本障礙，其主要特點有抗原設計靈活、可快速迭代篩選最佳免疫原、短時間內實現大規模生產。2024年10月，賓大團隊在Nature子刊詳細梳理了傳染病mRNA疫苗的最新進展。今天由菌菌帶領大家走進這篇綜述。

01

不同mRNA平臺概述

1.1 線性mRNA平臺

普通的線性mRNA主要由CureVac AG開創，已有數十年的疫苗研究測試，被證明是一種有效的傳染病疫苗。目前，普通mRNA序列中會引入某些修飾核苷用以增加蛋白質的產生、降低先天免疫反應。mRNA的關鍵考量點是其半衰期、穩定性、可翻譯性和炎症能力，這些特徵會影響mRNA疫苗的有效性和安全性。上述問題可以通過優化mRNA的結構元素5′cap、5′-UTR、CDS區、3′-UTR、poly(A)尾來得到改善（圖1）。其中非編碼元件、UTR、5′cap和poly(A)尾都有助於mRNA的穩定性，並在翻譯起始中起關鍵作用。截至目前，cap1(m7GpppNm)是使用最廣泛的帽類似物，其蛋白翻譯量明顯高於cap0，可以在IVT過程中直接使用帽類似物進行一步法加帽，也可以使用病毒加帽酶轉錄後加帽。

不同的5’UTR序列可能適用於不同的編碼序列、不同的物種、不同的靶細胞。爲此，耀海生物mRNA製備平臺建立了豐富的天然UTR庫、突變UTR庫，爲客戶CDS序列定製化篩選最適合的UTR序列。如感興趣可隨時聯繫菌菌：133 8033 2910。

同時，根據報道增加鳥嘌呤和胞嘧啶含量通常關聯於更高水平的表達。此外，降低mRNA的免疫原性也是疫苗研發的關鍵，可採用的方法有用假尿苷或N1-甲基假尿苷代替尿苷，從而降低尿苷依賴性免疫；並通過純化或RNase III處理以去除dsRNA雜質以降低炎症能力。

圖1 mRNA疫苗平臺

1.2 saRNA平臺

自擴增mRNA（Self-amplifying mRNA，saRNA）疫苗由於其複製能力，可以以較低劑量誘導保護性免疫反應，減少疫苗引起的不良反應事件並降低成本。saRNA的組成與mRNA類似，因此也可以開展相關的序列優化（圖2）。最近，對saRNA疫苗的研究有了新趨勢，就是利用雙重載體系統（反式擴增mRNA，taRNA），其中目標抗原和複製酶被編碼在不同的mRNA上。這種優化可以減少saRNA的長度，從而減輕RNA不穩定的問題，並且可以單獨對兩個不同載體進行優化。

耀海生物基於甲病毒VEEV來源的複製子序列，搭建了通用的saRNA轉錄載體，轉錄生成的saRNA在細胞內能夠實現高水平、超長週期的蛋白表達。如感興趣可隨時聯繫菌菌：133 8033 2910。

圖2 saRNA與circRNA疫苗平臺

1.3 circRNA平臺

越來越多的研究表明，環狀RNA (circRNA)可充當基因海綿、細胞活性調節劑。circRNA通常是通過合成一個或多個前體線性RNA，然後通過化學或酶連接方法進行環化而產生的。它是一種封閉的RNA，沒有5′cap和poly(A)尾，這種共價閉合結構使其能夠抵抗核酸外切酶的降解，顯著延長半衰期。通過改造circRNA載體、5'-UTR、3'-UTR或內部核糖體進入位點元件，可以實現circRNA的更好翻譯。目前，circRNA廣泛使用的最關鍵限制是生產問題，以及缺乏人類免疫原性和安全性數據。這主要是由於RNA環化效率低，且目前使用的circRNA不含修飾的核苷，可能會誘導較高的炎症水平。

02

mRNA遞送、免疫機制與生產

早期的mRNA疫苗主要利用如基因槍、電轉等物理方法進行遞送，但在臨牀試驗中效果並不佳。近年來，mRNA主要通過脂質納米顆粒（Lipid nanoparticles, LNP）完成遞送，其組分爲磷脂、膽固醇、聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)和陽離子脂質4種。據報道，LNP本身也是有效的佐劑，可以誘導機體產生強大的免疫保護反應。此外，目前聚乙烯亞胺、樹狀聚合物/超支化聚合物樹狀結構、聚（胺-共-酯）等新的載體也開始陸續用於saRNA、mRNA的遞送。mRNA疫苗的作用機制相對簡單，肌肉注射編碼一種/多種抗原的mRNA-LNP，表達出的編碼抗原被各種不同類型細胞吸收，然後被免疫系統識別並觸發免疫反應。根據劑量和類型差異，mRNA在體內持續數天或更長時間。

圖3 肌肉注射後mRNA-LNP的分佈情況

mRNA-LNP的製備流程通常包括序列合成、質粒的擴增與提取、線性化質粒模板的獲得與純化、IVT與mRNA純化、LNP包封、灌裝。具體爲，合成編碼目標mRNA的DNA模板，然後將其克隆到合適的mRNA生產質粒中。然後在適當的大腸桿菌菌株中擴增質粒，純化得到質粒模板，IVT製備得到mRNA。加帽可以在在IVT過程中進行，也可以在下游步驟中進行。純化mRNA的目的爲，去除流產RNA以及DNA模板。此步驟中用於質量控制有DNA含量、蛋白質含量、dsRNA含量、內毒素含量等。純化後的mRNA進行進一步的包封，得到mRNA-LNP。最終產品經過進一步測試（如粒徑、PDI、包封率以及mRNA濃度和內毒素含量、凍融穩定性）。其他的檢測還包括有，細胞轉染進行抗原的表達測試以及效價/免疫原性檢測。

03

傳染病mRNA的研究進展

3.1 病毒疫苗

季節性流感一直是mRNA預防性疫苗的重要疾病領域。目前，Moderna、Sanofi、Pfizer等多家公司都有佈局。目前，靶向多種抗原的多價mRNA季節性流感疫苗實驗結果也陸續披露，可誘導廣泛的免疫力。

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)會導致嬰兒、幼兒、老年人和免疫功能低下者患上嚴重的呼吸系統疾病。2024年6月，Moderna公司宣佈FDA已批准RSV-mRNA疫苗mRESVIA上市，是首款以單劑量預充式注射器供應的RSV疫苗，用於保護60歲及以上成年人免受RSV感染。

人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1, HIV-1)是最具挑戰性的疫苗靶點之一，因爲它具有遺傳多樣性、複雜的免疫逃避機制以及披露靶點免疫原性差諸多困局。但最近的實驗結果表明，saRNA/mRNA-LNP或鐵蛋白納米顆粒可以在轉基因小鼠中誘導體細胞超突變到廣泛中和抗體譜系。

此外，根據文獻報道，mRNA疫苗在人偏肺病毒、副流感病毒、黃病毒、出血熱病毒、狂犬病毒等病毒疫苗的研發中也都有進展。

3.2 細菌和寄生蟲

抗生素耐藥是一個巨大的醫療隱患，然而潛在疫苗靶點數量衆多、非蛋白質疫苗靶點和高度抗原變異，細菌的疫苗開發極具挑戰性。但最近的研究表明，mRNA疫苗似乎是適用於細菌的。有實驗披露，編碼四種結核抗原融合蛋白的saRNA-脂質無機納米顆粒在小鼠中顯示出一定程度的保護；使用伯氏疏螺旋體的外表面蛋白作爲疫苗靶點開發的針對萊姆病的mRNA-LNP疫苗，可誘導強大的細胞和體液免疫反應，並保護小鼠免受細菌攻擊（mRNA-1975/1982）；研究人員開發了一種針對艱難梭菌毒素和毒力因子的mRNA-LNP疫苗，這一多價疫苗在動物模型中引起了強大且長效的免疫反應。

致病性寄生蟲是一組多樣化的真核生物，然而由於真核細胞作爲疫苗靶點的複雜性以及它們逃避先天性和適應性滅菌免疫反應的能力，所以針對這些病原體的疫苗開發很困難。但可喜的是，最近mRNA疫苗在寄生蟲病的保護方面也取得諸多進展。例如，針對瘧疾的mRNA候選疫苗已進入臨牀開發（BNT165b1）；一種編碼瘧原蟲巨噬細胞遷移抑制因子的saRNA疫苗，改善了對肝臟期和血液期瘧原蟲感染的控制。

04

mRNA疫苗的挑戰與機遇

4.1 臨牀前模型的免疫原性與安全性限制

mRNA疫苗開發的一個普遍問題是臨牀前模型對人類免疫原性預測欠佳。如COVID-19 mRNA-LNP疫苗在小鼠中誘導強烈而持久的免疫反應，但在人類中的免疫反應和動力學卻不是特別理想。這種現象，同樣發生在流感/季節性流感mRNA疫苗中。非人靈長類動物(Non-human primates, NHP)模型似乎更好地反映了疫苗誘導的人類免疫反應。然而，它們價格昂貴使用存在倫理問題，並且某些情況下，由於NHP對某些感染是難以治癒的，因此無法評估疫苗誘導的保護作用。在人體中，mRNA-LNP疫苗可能會觸發動物模型中未預測的全身炎症反應。這一問題主要由於物種之間先天免疫差異所引起。此外，人對許多病原體預先存在的免疫力和免疫激活的各種狀態可能會影響反應原性，而這些也不能在動物中被模擬。

4.2 疫苗誘導所需免疫反應的侷限

上呼吸道是呼吸道病毒的入口與傳播場所，因此在病毒預防中即爲重要（圖4）。引發上呼吸道免疫的最直接方法是通過鼻內或口服給藥，使疫苗安全有效地輸送到粘膜表面。但是由於難以攝取和毒性差，目前大多數mRNA-LNP都不能實現高效黏膜遞送。同時，LNP表面的PEG成分已被確定爲脫靶抗體反應的罪魁禍首。但抗PEG抗體水平的增加可能會導致某些患者羣體中使用的其他聚乙二醇化藥物的清除速度更快，因此效果較差。因此，具有較低免疫原性的PEG替代品是mRNA-LNP平臺研究的新方向。

圖4 呼吸道病毒粘膜免疫機制圖

4.3 多組分疫苗及其劑量方面的挑戰

多價mRNA-LNP疫苗是近來研發的新趨勢，但可能導致異聚化的問題。如當mRNA疫苗在同一細胞中表達多種不同SARS-CoV-2變體S蛋白時，可能會形成由來自不同變體組成的三聚體。而異源三聚體的形成會導致所得蛋白質的錯誤摺疊，從而無法實際反映糖蛋白表面的中和或保護表位。此外，多價或多組分疫苗的另一個問題爲，如果一種成分是主要免疫組分。則可能需要通過調整疫苗中不同mRNA的比例來克服，例如，降低編碼顯性成分的mRNA量。

劑量選擇也是mRNA疫苗臨牀開發的一個重要方面。目前，50μg mRNA劑量似乎是當前人類預防性疫苗的耐受性上限，這代表了多價mRNA-LNP疫苗中包含的抗原成分的最大量。但在多價疫苗，如流感病毒4價mRNA-LNP候選疫苗（mRNA-1010），按平均值計算則每個構建體只能使用12.5 μg。目前，尚不清楚這些低劑量是否能在機體中誘導足夠強大和持久的免疫反應。

4.4 短週期和低成本的顯著優勢

mRNA疫苗的一個關鍵優勢是其靈活性，特別是對於需要頻繁更新的疫苗。以流感病毒爲例，基於病毒的滅活疫苗每年都會更新，以反映流行的毒株。每年根據監測和預測選擇疫苗配方成分，疫苗的生產則大約需要6個月，經歷如此長週期的研發，疫苗極大可能已與流行的毒株不匹配，從而對疫苗有效性產生重大負面影響。而mRNA疫苗已可在2個月甚至更短時間完成生產，將其應用於一直迭代的病毒株極具優勢。

圖5 mRNA疫苗生產的簡單性

疫苗篩選時，一般會在幾種候選藥物中同時測試一種抗原的許多不同版本或病原體的許多不同抗原，以優選出最佳候選疫苗。但這同時伴隨着鉅額的研發經濟成本和時間成本。mRNA疫苗好處在於，對於同一病毒可以突破抗原序列迭代的優勢，使用相同的工藝進行生產，無需像其他疫苗一樣對每種候選疫苗進行繁瑣的工藝優化或靶抗原調整。未來，mRNA疫苗的這一顯著優勢，可能會使得表達多種不同蛋白且最佳靶點未知的病原體疫苗開發取得突破，比如結核病、瘧原蟲在內的不同寄生蟲，甚至是具有大基因組和未知保護性抗原的DNA病毒，如非洲豬瘟病毒。而且mRNA-LNP整個製備過程無需使用真核細胞，這減少了外源因子的干擾。

05

總結

基於核苷修飾的mRNA-LNP製劑，近年來顯示出巨大的前景。然而，基於RNA疫苗的全部潛力還遠未實現，需要進一步優化以解決當前的侷限性。因此，開發具有更高免疫原性、穩定性和更低反應原性以及具有誘導粘膜免疫反應能力的新型RNA疫苗是未來的優化方向。mRNA疫苗設計和製造的靈活性和易用性可能會徹底改變抗原選擇和疫苗開發，並可能促使以前難以捉摸的病原體設計疫苗成爲可能。對mRNA疫苗作用機制的更深入理解將指導下一代mRNA疫苗的設計。

參考文獻

[1] Pardi N, Krammer F. mRNA vaccines for infectious diseases - advances, challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2024 Nov;23(11):838-861. doi: 10.1038/s41573-024-01042-y.

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撰寫| 工程菌星球

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice