CCK8 新手村：實驗心得整理

來源：丁香園論壇

作者 @ 呆呆的初行者

一直都像個新手，從未老道過。所有新手的迷茫與無奈我最能體會。看到園子裡有一些同學在問有關 CCK8 試驗的事情，當初我也和他們一樣，像個被蜘蛛絲纏住頭的迷茫蒼蠅一頭扎進園子裡，期待能找到些解決謎團的隻言片語。希望我寫的這些非專業文字能夠幫助那些在實驗室裡沒有前行者指點迷津的筒子們。當然仁者見仁智者見智，我寫的只是個人實驗心得，僅供參考。歡迎大家拍磚共同進步。實驗是簡單的，道路是曲折的，時間就是用來浪費的，科研就是自娛自樂使勁折騰。

我沒有做過 MTT 實驗，但其實原理及目的都是一樣的（反應機理不一樣）。都說 CCK8 簡單點而且數據更穩定，所以就用了這個試劑盒。

CCK8 的說明書大家一定要認真閱讀，裡面很多細節的問題都有提到。而且說明書裡提供的一些關於各種細胞的種板數都很有參考價值，因爲那是反覆驗證過的最佳數值。但無論如何，做這個試驗一定要摸條件。你就算再懶，這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細胞毒性試驗爲前提，如果你做的是促進細胞生長的藥物的藥效實驗那就另當別論了。

摸條件包括：

1、種板數；

2、種板後細胞的貼壁生長時間；

3、加藥後的孵育時間；

4、cck8 試劑加入量；

5、cck8 試劑加入後細胞孵育時間。

看起來很多，其實這就是一個實驗。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細胞和 CCK8。

1、種板數：這個要查文獻，看你所用細胞別人有無做過，把範圍大致找出。記住還要參考說明書，這個很重要。然後稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長時間細胞可貼壁完全，一般貼壁生長 24 小時。然後還有在你的實驗時間內，不同細胞數下孔內生長情況。比如我擬定考察 4 天的時間，那麼在 4 天內，細胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因爲每塊板都會設置對照孔，也就是含有細胞的培養基+CCK8，這個數值是板上的最大數值，CCK8 試驗最佳 OD 值在 1.0 附近，所以這個最大數值最好能控制在 1.0 左右。我的實驗經驗是不要讓細胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生長了，對藥物能否順利進入細胞有影響此爲其一，其二生長不均勻易導致孔間 OD 值數據偏差大，而且 OD 值也很大。

2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長 24 h 了，這個時間細胞已經貼壁完全，而且這樣設置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人願意大半夜爬起來做實驗吧。

3、加藥後的孵育時間，我的實驗摸了 3 個時間，24 h，48 h，72 h。然後根據數據的穩定性（RSD）、OD 值的範圍（1.0 左右）這些來選擇最好的時間。太長了就沒有必要了，細胞呆在孔裡幾天不換液結果可想而知了。

4、CCK8 試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量爲培養基體積的 10%。這裡有一個問題：假設我要孔內是 200 微升的體系，即細胞懸液+藥液+CCK8 = 200 微升呢，還是細胞懸液+藥液 = 200 微升，cck8 不算在體系內呢。關於這一點文獻報道不一致。本人最終採用的是後者。

5、cck8 試劑加入後孵育時間，隨着時間的增加，OD 值就會增大。總之原則就是把 OD 值控制在 1.0 左右。這裡我考察了 0.5 h、1.0 h、2.0 h。

再說一下關於種板設置問題。衆所周知周圍一圈孔因爲邊緣效應都是不用來做實驗的。一般每組樣品我會設置 6 個復孔，得到的 OD 值去掉最大值與最小值，其餘取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣，但是也會增大組內誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個實驗我想大家遇到的最大問題應該是數據不穩定，組內數據偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把 OD 值控制在 1.0 左右。數據不穩定也只能通過增大樣品數，藉助數據處理來彌補。還有實驗操作一定要仔細小心，儘量平行操作。

能力有限，表達不清的大家湊合着看看吧。有疑問的歡迎大家留言討論，我們的目標是共同進步，哈哈。

補充：謝謝大家的熱烈討論。突然想起用酶標儀檢測的時候還有一些細節問題，園子裡也有前輩提過。比如孔裡不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會很影響檢測結果。樣品板要擦拭乾淨，當然了，蓋子一定要記得拿掉啊

補充說明：這幾天有同學提出了一個問題，這個問題非常好也非常關鍵：將 OD 值控制在 1.0 這個說法是否有依據？

這裡我還是想提醒大家一定要認真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市並且作爲技術手段得到認可需要經過多少試驗反覆驗證。我購買的是同仁化學研究所的 CCK8 試劑盒，說明書的 P7Q23：OD 值在什麼範圍比較合適？答：一般情況下 OD 值在 0.1-2.0 都可以，在 1.0 附近比較好。

再說到自己的實驗設計，酶標儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所以 UV 上很多減小誤差的注意事項在酶標儀上同樣受用。這就能夠理解爲什麼不能有氣泡，爲什麼要擦拭乾淨樣品板了。再者熟悉 UV 原理的同學會瞭解利用紫外檢測有一個最佳檢測範圍，超過了這個範圍，數值就會呈現出不穩定，無規律。（大家可以把自己的數據統計分析看看是不是數值控制在 1.0 附近更穩定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測範圍，儀器讀數爲 —。我在摸條件的時候，cck8 加入 2.0 h 後檢測就出現過酶標儀讀不出數據的情況。

@ 呆呆的初行者：前輩好。我也有考慮過測之前換液，不過說明書上說酚紅對檢測不影響，就偷懶沒有換。不過想請問換液是直接用吸管將廢液吸走嗎，要吸很乾淨嗎？

@ 梧桐如雪：不好意思，已經回你消息啦。槍頭吸會更乾淨些哦！操作熟練後基本可以控制每次的實驗誤差在 10% 或 20% 之內。檢測之前最好鏡檢，要相信自己看到的，而不是一味遵從比色數據。我就是因爲每次鏡檢，纔會發現很多顯色液使用過程中的問題，再加以改進，直到理論數據與實際看到的相符。不要懷疑自己的能力，有時候只是細節方面沒有做好罷了，我們一味照本宣科了，太迷信產品說明，沒有做足預實驗。

說下最近遇到的問題，也許會對一些人有些幫助。測活用的細胞株的藥物敏感度是最重要但是也是很容易被忽視的問題。如果你不是用原代的話，商品化的細胞株有個很致命的問題就是細胞代次。測活用的細胞不能有所變異或者功能退化，這很致命，但這是不停的傳代必然導致的問題。我一直堅持認爲要用從 ATCC 購買的細胞，在小代數以內儘可能凍存儘量多的細胞。這回貪便宜在某院細胞所買了一株未知代數的細胞株（再具體就不說了，大家心裡明白啊，呵呵），我花了大半年時間幾乎沒有任何實驗結果，最後用干擾素一測，該細胞壓根兒沒有反應 …… 崩潰了！捱了很多批評不說，自己的信心差點丟失了。現在又要花兩個月的時間去買ＡＴＣＣ的細胞，真的很得不償失的。說下ＡＴＣＣ的細胞價格，官網價格乘以１８，就是人民幣的價格，代理商麼大陸就一個，我就不作宣傳了，大家可以自己去查。最好走正規代理商，運輸歷時近兩個月，小代萬一出問題了，賠償問題很糾結的。如果你的產品最後需要申報，細胞來源也需要證明，當然走正規渠道比較放心些。

@barin：非常感謝樓主的提示。此次實驗基本認爲要失望了。總結做過的 2 次 CCK-8 實驗經驗，更準確的話說是失敗經驗如下：

1）CCK-8 加法：沿側壁加入，避免產生氣泡。還有一個技巧是用 1：1 體積的培養基混勻後加入，這樣起到減小加樣誤差。

2）CCK-8 使用之前，先做個標準曲線。用不同的細胞數接種，然後加入 CCK-8 1 小時，2 小時，3 小時檢測 450nm 以 OD 值 1.0--2.0 爲標準選擇細胞數。

3）確認藥物跟 CCK-8 不反應。在培養基中加入 CCK-8，2-3 小時後檢測。以及在培養基中加入藥物和 CCK-8，2-3 小時後檢測。檢測出來的 OD 值爲空白對照，以不超過 0.3 爲標準。

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