大腸菌羣、糞大腸、大腸埃希氏菌檢驗的相關知識

1、大腸菌羣、糞大腸菌羣和大腸埃希氏菌檢驗方法

1) 大腸菌羣（colifoms）

一羣在36°C培養48h可發酵乳糖產酸產氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

該菌主要來源自人畜糞便，作爲糞便污染指標評價食品的衛生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。

2) 糞大腸菌羣（Fecal colifoms）

也稱耐熱大腸菌羣。指大腸菌羣中能在44.5C生長、發酵乳糖產生氣體的一羣細菌。

與大腸菌羣一樣，並非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面並非完全一致。

食品衛生學意義：作爲糞便污染食品的指標菌，MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低。

作爲腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌羣數量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間並不總是呈平行關係。

3) 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）

分類學概念：腸桿菌科、埃希氏菌屬。是人和溫血動物腸道內普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中並不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染。主要有：

■ O抗原(菌體抗原，150個)

■ K抗原(莢膜抗原，90個)

■ H抗原( 鞭毛抗原，50個)

4) 致瀉性大腸埃希氏菌

能侵入腸粘膜上皮細胞,引起食物中毒的大腸埃希氏菌。產毒性大腸埃希氏菌(ETEC)-腸胃炎、旅行性腹瀉。

■ 致病性大腸埃希氏菌(EPEC) — 嬰兒腹瀉；

■ 腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)—出血性結腸炎；(O157∶H7；O104∶ H4；O111；O126等)

■ 侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)—桿菌性痢疾；

■ 粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)—急慢性腹瀉。

2、大腸菌羣、糞大腸菌羣、大腸埃希氏菌的關係

3、相關檢驗方法標準

■GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌羣計數

■GB 4789.38-2012 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數

■GB 4789.39-2013 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 糞大腸菌羣計數

■GB 4789.6-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗

■GB 4789.36-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗

4、大腸菌羣和糞大腸菌羣的檢測流程圖

5、大腸菌羣計數檢驗的操作

1) MPN法：

結果報告：根據經確證後的對應濃度陽性管數查MPN表（MPN：最可能數，基於泊松分佈的一種間接計數方法）

2) VRBA平板計數法

結果報告

經最後證實大腸菌羣陽性的BGLB試管比例乘以VRBA菌落數再乘以稀釋倍數，即爲每克（毫升）樣品中大腸菌羣數。

如：稀釋倍數10-3，吸取樣品稀釋液1mL平板典型或可疑菌落數100挑取10個典型或可疑菌落接種BGLB→陽性6管。

6、大腸埃希氏菌MPN計數法檢驗程序

7、大腸埃希氏菌在EMB上的菌落形態

具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

8、靛基質試驗(呵噪試驗)(I)

■ 原理：某些細菌能分解蛋白質生成呵器，呵跺與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰呵噪紅色化合物。

■ 培養基：色氨酸肉湯。

9、甲基紅反應(MR)

腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由於糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

■ 培養基：MR-VP培養基。

10、V-P試驗(VP)

某些細菌在葡萄糖蛋白陳水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，後者在強鹼環境下，被空氣中氧氧化爲二乙酰，二乙酰與蛋白陳中的肌基生成紅色化合物，稱V一P（+)反應。

36℃±1℃培養48h，加數滴甲基紅溶液。

11、檸檬酸鹽利用試驗

有的細菌如產氣桿菌，能利用檸檬酸鈉爲碳源，因此能在檸檬酸鹽培養基上生長，並分解檸檬酸鹽後產生碳酸鹽，使培養基變爲鹼性。此時培養基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變爲深藍色。不能利用檸檬酸鹽爲碳源的細菌，在該培養基上不生長，培養基不變色。

12、大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑑別

■ 大腸埃希氏菌爲革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發酵乳糖、產酸、產氣，IMViC 生化試驗爲﹢﹢﹣﹣或﹣﹢﹣﹣。只要有1個菌落鑑定爲大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即爲大腸埃希氏菌陽性。依據LST肉湯陽性管數查 MPN 表（見附錄B），報告每 g (mL）樣品中大腸埃希氏菌 MPN 值。

13、大腸埃希氏菌平板計數法（第二法)

14、大腸埃希氏菌平板計數

1) 選取2～3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。

2) 將10 mL～15 mL冷至45℃±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固後，再加3 mL～4 mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固後翻轉平板，36 ℃±1℃培養18 h~24 h。

3) 選擇菌落數在10 CFU～100 CFU之間的平板,暗室中360nm～366 nm波長紫外燈照射下，計數平板上發淺藍色熒光的菌落。

4) 檢驗時用已知MUG陽性菌株做陽性和陰性對照。

18、大腸埃希氏菌平板計數的報告平板計數的報告

兩個平板上發熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數，以CFU/g(mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。

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