專訪祁峰丨大腸桿菌內實現四氫生物喋呤自給自足和血清素生產
2021 年的網絡用語中，emo 一詞可謂火遍全網。這一網絡用語被大家用來形容各種負面情緒，比如抑鬱、不開心、悲傷、失落和不如意等，帶着“三分戲謔、五分自嘲和兩分無奈”。事實上，根據世衛組織 2021 年發佈的數據，世界上大約有 2.8 億人患有抑鬱症。據流行病學調查，中國抑鬱症終生患病率爲 6.8%，目前我國患抑鬱症人數近 1 億左右。
這一龐大的數字不得不引起公衆的重視，血清素（即 5-羥色胺）作爲一種能產生愉悅情緒的信使也受到了關注，它是一種抑制性神經遞質，在臨牀和製藥領域具有較多應用，如調控情緒、管理行爲、維持睡眠週期和清除體內有害自由基等。它幾乎影響大腦活動的每一個方面：從調節情緒、精力、記憶力到塑造人生觀，如抗抑鬱症藥鹽酸氟西汀就是通過提高腦內 5-羥色胺水平而起作用的。
血清素在體外可由其前體 5-羥基色氨酸（5-HTP）經過一步轉化獲得，5-HTP 的主要來源依靠植物組織提取。目前，已知加納穀物的種子中 5-HTP 含量很高，因此該植物是目前市場上主要的 5-HTP 的來源，但是栽培的地域限制以及原材料的不足嚴重影響了 5-HTP 的工業化生產，進而影響了通過這種方法獲得的血清素產量。近年來，隨着現代合成生物學的飛速發展，利用代謝工程改造過的大腸桿菌作爲細胞工廠生產血清素的方法逐漸被若干科研人員所實踐。
（來源：Pixabay）
近日，福建師範大學祁峰教授團隊在 ACS Synthetic Biology 上發表了以“Engineering Metabolic Pathways for Cofactor Self-Sufficiency and Serotonin Production in Escherichia coli”的研究論文，證實了使用大腸桿菌生產高水平血清素的前景。
藉此機會，生輝 SynBio 邀請到了福建師範大學的祁峰教授來與我們分享他的研究內容及進展。
祁峰於 2011 年博士畢業於北京理工大學，師承我國著名合成生物學專家李春教授；2012 年在清華大學化學工程系應用化學研究所從事博士後研究期間接觸合成生物學領域至今；2017-2018 年美國萊斯大學（Rice University）訪問學者，合作導師爲 George N. Bennett 教授；現爲福建師範大學生命科學學院教授，研究方向爲微生物合成生物學和生物能源等。
福建師範大學是福建省與教育部共建高校、福建省重點建設高校。目前祁峰的課題組所在實驗室是福建師範大學“工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心”，包括 1 個教育部級科研平臺（工業微生物教育部工程研究中心）和 2 個省級科研平臺（“福建省現代食品發酵技術工程研究中心”和“福建省工業微生物高通量選育保藏平臺”）。
在大腸桿菌內實現四氫生物喋呤自給自足和血清素生產
前期，祁峰團隊所做的工作主要是以葡萄糖或甘油爲碳源從頭合成血清素，或通過全細胞催化的手段，以 L-色氨酸作底物經羥化和脫羧兩步反應合成血清素。
然而，胞內 L-色氨酸作底物的羥化反應需要較多的重要輔因子四氫生物喋呤（BH4）的存在，此前，也有報道將外源 BH4 循環途徑導入細胞促進強化反應的研究，但是由於 BH4 內源產量不足導致 5-HTP 和血清素產量很低。
在這篇文章中，祁峰團隊首先優化了異源血清素合成途徑中的兩個關鍵酶即色氨酸羥化酶和脫羧酶，然後將 BH4 的生物合成和再生模塊相結合導入大腸桿菌基因組中，通過進一步的代謝工程改造，包括增強 BH4 前體 GTP 的生物合成和提高胞內還原性輔因子 NADH/NADPH 的可用性以確保充足的內源性 BH4 的供應。使用優化的分批補料發酵，實現了 40.3%（mol/mol）的總體最大血清素產量和 1.68g/L 的峰值滴度（產率爲 0.016g/L/h）。該研究採用的策略顯示了使用大腸桿菌進行四氫生物喋呤自給自足和高水平血清素生產的前景，展示了工程菌株在工業應用中的潛力。
（來源：ACS Synthetic Biology）
祁峰也透露，大腸桿菌作爲細胞工廠，也存在普遍的缺陷，例如質粒丟失導致後期發酵時產量不穩定和菌株安全性等。因此，團隊也正嘗試以其他細胞工廠爲底盤細胞合成血清素及其他氨基酸衍生化合物。
除了血清素，祁峰課題組利用原核微生物如大腸桿菌和類球紅細菌等底盤細胞所做的工作包括利用大腸桿菌細胞工廠高產芳香族氨基酸（如色氨酸和苯丙氨酸）及其衍生物（如生長素、5-羥基色氨酸、5-羥色胺和褪黑素等）；利用類球紅細菌高產輔酶 Q(10) 和法尼醇等萜烯類化合物，目前高產輔酶 Q(10) 的類球紅細菌已經實現工業化應用，與福建省內兩家公司形成了戰略合作。芳香族氨基酸類衍生物產品正在進一步完善產業化研究。另外，祁峰實驗室還有真核微生物如破囊壺菌和圓紅冬孢酵母，主要利用破囊壺菌細胞工廠生產 DHA ，以及改造圓紅冬孢酵母生產微生物油脂和類胡蘿蔔素類產品。
生物能源：木質纖維素的綜合利用
除了微生物代謝工程，祁峰在生物能源方面也有一些涉獵，而具體接觸這一研究項目還要追溯到其博士後。“2011-2014 年期間，國際油價高漲，我所在的研究小組主要是以動植物油脂或廢棄油脂（地溝油）爲原料，由甲醇或乙醇在催化劑作用下經酯交換或酯化反應制成脂肪酸甲（乙）酯即生物柴油。生物柴油爲國際公認的可再生清潔能源，主要用於動力燃料和生物基材料領域。後來由於石油價格回調，我們將主要研究方向聚焦在利用產油脂微生物生產高附加值食用或飼料添加劑油脂等研究領域。”
就生物能源領域而言，祁峰團隊目前仍關注的是木質纖維素的綜合利用。木質纖維素是自然界中最爲豐富的有機物。據估計，植物每年通過光合作用產生的幹物質高達 1500-2000 億噸，是地球上唯一可超大規模再生的實物性資源。我國每年產生的農業作物秸稈有 7 億多噸，相當於 3.5 億噸標準煤，森林採伐加工剩餘物 1000 多萬噸，蔗渣 400 多萬噸，但每年用於工業過程或燃燒的纖維素資源僅佔 2% 左右，絕大部分還未被利用。
近幾十年由於化石資源短缺日趨嚴峻和環境污染日益嚴重，以來源廣泛且可再生的木質纖維素爲原料製造生物能源和工業化學品受到了世界各國的廣泛關注。其中以生物技術爲核心的木質纖維素的生物轉化已經成爲生物能源開發、生物質資源加工和綠色化工過程的關鍵技術之一，相關研究也已成爲當前工業微生物技術的一個熱點和難點。
祁峰表示，目前木質纖維素作爲生物能源利用的難點在於木質素的降解和綜合利用。在我國“缺油少氣”的能源結構下和“雙碳”戰略上升到國家層面之後，我國生物質能源的利用和發展前景非常好，舉例來說比如生物質發電空間巨大，可以有力緩解我國用電壓力。結合生物能源與碳捕獲和儲存技術（BECCS），生物質能源能將創造負碳排放，並在各個領域爲我國作出巨大的減排貢獻。
▲圖丨生物質發電廠（來源：oschatz）
“合成生物學技術的發展爲生物能源領域開拓了新的實現和應用途徑”
“不過，生物能源目前的確還不算是一個成熟的產業，但是生物能源作爲一種可持續性能源形式，是最有望替代傳統能源、能大規模開發、有利於保護環境和解決能源危機的，同時也可以帶動其他新興生物能源產業的發展。”
生物能源的開發利用是我國能源可持續發展規劃的重要內容，同時也是我國 21 世紀能源發展戰略的重要方向。進入 21 世紀以來，受氣候變化加劇、農產品結構性過剩以及地區衝突牽制石油供應等多重因素影響，全球生物能源產業發展明顯加速。2018 年全球生物燃料乙醇產銷量約 8000 萬噸，生物柴油產銷量近 4000 萬噸，生物質能源發電裝機累計容量達到 3.7×10(10)W，以生物質爲燃料的熱電聯產甚至成爲一些國家的主要發電和供熱手段。
祁峰此前曾與國家電網新能源部門有所接觸和合作，他表示，以生物質爲燃料的熱電聯產當然還是以木質纖維素直接燃燒來實現。然而，對於生物柴油和燃料乙醇，如果能夠充分利用存量巨大的木質纖維素爲供應鏈，其成本和產能將會有極大的提升。但是木質纖維素作爲生物能源有效利用的困難仍然在於木質素的降解分離和低成本處理及綜合利用，若能完全解決這些問題，很大程度上會打通利用生物能源的供應鏈，而合成生物學技術的發展爲生物能源領域開拓了新的實現和應用途徑。
採訪的最後，祁峰也對各類生物能源以及合成生物學在其中的應用發表了自己的看法：
1）生物柴油
生物柴油是指通過生化手段從水生植物、油料作物和動物油脂等生物能資源轉化而來的高脂酸甲烷，可用以替代傳統柴油。生物柴油相對於傳統柴油具有抗爆性強、十六烷值高、點火性優、流動性好、安全性高等特點，且不含芳香烴類等致癌類有害成分。生物柴油的能量消耗量佔傳統柴油的 25%，可實現低污染和低排放，是優質的綠色能源，其生物降解率高達 98%，爲傳統柴油的 2 倍。在傳統柴油中加入約 20% 的生物柴油後，硫化物和碳氧化物的排放量可分別降低 70% 和 13%。現在的生物能源產品以利用轉基因大豆油、菜籽油與蓖麻油等植物油生產的生物柴油居多，可廣泛推廣使用。目前利用合成生物學策略，使一些產油微生物如酵母和大腸桿菌等生產生物柴油，能夠避免使用植物和動物油脂，真正做到“不與人爭糧，不與糧爭地”。國際著名的合成生物學公司 Amyris 就曾經在早期佈局過生物柴油項目。
2）生物乙醇
生物乙醇可用於優質油品的品質改良，其來源於植物，是酒精的加工產物。生物乙醇的使用旨在調和我國油品的高辛烷值，進一步提高我國的油品的品質，其不僅具有與酒精相同的功能特徵，而且比甲基叔丁基醚的增氧效果高 1 倍以上。現存油品改良劑主要有甲基叔丁基醚、生物乙醇和乙基叔丁基醚三種，生物乙醇改良劑在我國已推廣使用，收到顯著效果。現階段利用合成生物學技術強化釀酒酵母生產生物乙醇取得了顯著進展，爲國內生物質乙醇生產企業如河南天冠、安徽豐原和黑龍江華潤等提供了可靠的技術保障。以河南天冠爲例，30 萬噸燃料乙醇項目建成後，年消化陳化小麥 105 萬噸，可解決 330 萬畝小麥的銷售問題，實現農業銷售收入 11 億元，減少財政補貼 2 億多元，可實現農民增收、財政減補、企業增效的多重經濟效果，對穩定和調控糧食價格、促進農業產業化具有顯著的拉動作用。
3）生物制氫
生物制氫是利用厭氧細菌或光合細菌，利用碳水化合物供氫體所製備的氫氣。生物制氫以糖、澱粉、豆品、釀酒和麥乳製品等的加工廢水，以及麩皮、糟渣類、秸稈等農業廢棄物爲原料。生物制氫不僅可滿足生產和日常生活所需的氫氣來源，還可實現廢物的重新回收利用。通過對產氫氣細菌的合成生物學改造使其具有厭氧或好氧條件下利用生物質製備氫氣的能力。目前殼牌石油（Shell）和波音公司都在關注和投資生物制氫這一領域。