中科院1區 Adv Sci | 揭示旋覆花內酯的胃癌鐵死亡機制
在多種多樣的去泛素酶中，泛素特異性蛋白酶 7 (USP7)，也稱爲皰疹病毒相關泛素特異性蛋白酶 (HAUSP)，屬於最大的 USP DUB 家族。USP7與該胃癌GC的發生、進展、免疫反應和化療耐藥性相關。最近的一項研究表明，源自核糖體蛋白 S19 (circRPS19) 的環狀 RNA 通過 USP7 介導的去泛素化上調己糖激酶 2 (HK2)，從而誘導 GC 細胞中的有氧糖酵解並促進 GC 進展。此外，USP7 在上游發揮作用，調節程序性死亡配體 1 (PD-L1)，這是一種參與癌症免疫抵抗和生長的蛋白質。靶向USP7可能會削弱PD-1和PD-L1之間的相互作用，使GC細胞對T細胞介導的殺傷敏感並增強抗腫瘤免疫力。在 GC 內的癌症相關成纖維細胞 (CAF) 中，USP7 去泛素化並穩定異質核核糖核蛋白 A1 (hnRNPA1)，促進 miR-522 包裝到外泌體中。該過程導致 ALOX15 抑制並減少 GC 細胞中脂質-ROS 積累，最終導致化療敏感性降低。然而，對 USP7 調節 GC 的機制（包括新底物和信號網絡）的全面瞭解仍然難以實現。
2024年3月9日，中國科學院杭州醫學研究所覃江江研究員、程向東研究員及上海中醫藥大學張衛東教授團隊在Adv Sci （中科院1區，if14.3）在線發表了題爲”Blocking Ubiquitin-Specific Protease 7 Induces Ferroptosis in Gastric Cancer via Targeting Stearoyl-CoA Desaturase“的文章。揭示旋復花內酯DHPO可靶向USP7降解硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD誘導的胃癌鐵死亡。
摘要
胃癌（GC）對全球健康構成巨大挑戰，傳統療法面臨療效侷限性。泛素特異性蛋白酶7 （USP7）在胃癌的發生、免疫應答和化療耐藥中發揮重要作用，是一個很有前景的治療靶點。多種USP7抑制劑在臨牀前研究中顯示出選擇性和療效。然而，USP7的作用機制尚未完全闡明，目前也沒有任何USP7抑制劑被批准用於臨牀。在本研究中，通過計算機模擬篩選，DHPO被確定爲一種有效的用於胃癌治療的USP7抑制劑。DHPO在體外具有顯著的抗腫瘤活性，抑制細胞活力和克隆形成能力，阻止腫瘤的遷移和侵襲。體內研究使用原位胃腫瘤小鼠模型驗證了DHPO抑制腫瘤生長和轉移的功效，且無明顯毒性。在機制上，抑制DHPO可觸發鐵死亡，這一點可通過線粒體改變、脂質活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）積累和鐵過載得到證明。進一步的研究揭示了USP7通過去泛素化調節硬脂酰輔酶a去飽和酶（SCD），將USP7抑制與SCD降解和鐵死亡誘導聯繫起來。綜上所述，本研究確定了USP7是GC鐵死亡的關鍵參與者，闡明瞭DHPO的抑制機制，並強調了其通過SCD調控誘導鐵死亡的GC治療潛力。
1.USP7 鑑定爲 GC 致癌驅動因素
對來自 DepMap 數據集的 siRNA 和 CRISPR 數據進行了全面分析，特別關注 USP7。簡而言之，從這些數據集中提取了 USP7 的依賴性得分，表明基因對細胞系生存至關重要的程度。-1 分表示完全基因組致死，而 0 分表示沒有明顯影響。我們的分析揭示了兩個數據集中 GC 中 USP7 的顯著富集（圖 1A、B），強調了其與疾病的潛在相關性。隨後，我們使用 CVCDAP（一個可公開訪問的癌症信息學數據庫）探索了人類 GC 組織中 USP7 丰度的變化。與正常胃組織相比，GC 組織中 USP7 的 mRNA 表達更高（圖 1C）。爲了評估 USP7 對 GC 細胞增殖的影響，我們計算了 TCGA、ACRG 和浙江隊列中所有樣本的 USP7 和 Ki-67（細胞增殖標誌物）mRNA 表達之間的 Pearson 相關係數。值得注意的是，分析表明 USP7 和 Ki-67 在所有三個數據集中均呈正相關（圖 1D）。總的來說， USP7 與 GC 中 Ki-67 表達的調節之間存在潛在的功能聯繫。此外，利用 128 名患者的內部隊列探討了 USP7 在 GC 中的臨牀相關性。採用組織微陣列 IHC，我們觀察到 GC 組織中 USP7 相對於腫瘤旁組織的上調（圖 1E）。此外，USP7的表達升高與GC的不良預後相關（圖 1F）。這些觀察結果強調了 USP7 在 GC 中的臨牀意義，並強調了其作爲治療靶點的潛力。
圖1 USP7是胃癌（GC）的致癌驅動基因
2.基於結構的計算機模擬和GC細胞篩選確定了一種新型USP7抑制劑
鑑於目前美國食品藥品監督管理局（FDA）尚未批准USP7抑制劑用於臨牀，我們努力尋找一種用於治療GC的新型USP7抑制劑。在本文中，進行了基於計算機模擬結構的篩選，然後進行了細胞毒性GC細胞分析（圖2A）。在計算機模擬中篩選了超過3000種化合物的庫，以USP7的晶體結構作爲活性位點環的主要構象。選取對接分數較好的化合物在0、1、10和100µM濃度下對MGC803細胞的細胞毒性。最後，一種被稱爲DHPO （2α，6α-二乙酰氧基-4β-羥基11-假愈木烯-12,8α-內酯，分子量= 366 g mol -1）的化合物（圖2B）在兩種篩選中均成爲頭號候選化合物，因爲其可與USP7結合，並且在GC細胞中具有細胞毒性作用。根據計算模型，DHPO被預測位於USP7變構位點的間隙內。它的定位使其反應中心接近Cys300，而Cys300距離催化三聯體約12 Å。催化三聯體位於USP7催化域手掌、手指和拇指子域的界面（圖2C）。這種排列通過邁克爾加成機制促進共價鍵的形成。重要的是，這種結合相互作用在空間上阻礙了泛素的結合，並阻止了USP7催化域中的α5螺旋向其活性構象的轉變。DHPO和USP7的直接結合被一種稱爲MST的獨立檢測方法證實，在13.97µm的Kd下檢測到穩健的結合曲線（圖2D）。進一步評價所述化合物的抗gc活性。我們的結果表明，DHPO處理導致MGC803和MKN1細胞的細胞活力呈濃度依賴性降低（圖2E）。在檢測的最高濃度（25µm）下，72 h後細胞活力降低了95%以上。與對接模型一致，LC/MS分析顯示DHPO與重組USP7蛋白結合。MALDI-TOF-MS顯示，當與DHPO孵育時，野生型USP7蛋白的質量位移約爲366 Da，這是由邁克爾加合物（Michael addition）引起（圖2F），邁克爾加合物是DHPO的化學加合物的預測分子量。爲了進一步鑑定對結合過程至關重要的殘基，我們進行了MS分析，以檢測DHPO體外修飾的半胱氨酸殘基。覆蓋Cys300（氨基酸294-301）的糜蛋白酶肽質譜分析顯示質量增加了366，表明Cys300被DHPO烷基化（圖2G）。綜上所述，這些結果表明DHPO與GC細胞中具有催化作用的Cys300共價結合。
圖2 新型USP7抑制劑DHPO的鑑定
3.DHPO在體內外抑制胃癌的生長和轉移
爲了進一步探索DHPO的抗gc效果，對MGC803細胞進行了RNA-seq分析，並鑑定了DHPO處理和未處理細胞之間的差異表達基因（Padj < 0.05, log2 fold change >1）。共有172個基因表達上調，266個基因表達下調。通路富集分析確定DHPO調控的潛在信號通路。分析發現，DEGs與細胞增殖相關通路（如Ras信號，PI3K-Akt信號，MAPK信號，AGE-RAGE信號），以及轉移相關通路（包括Focal adhesion和Rap1信號）相關（圖3A）。這些結果表明DHPO抑制胃癌細胞的生長和轉移。如圖3B所示，在克隆形成實驗中，DHPO顯著降低了GC細胞的克隆形成能力。與對照組相比，抑制劑處理的細胞集落數量和大小明顯減少（圖3B）。在傷口癒合實驗中，與對照組相比，DHPO延遲了傷口的閉合（圖3C）。同樣，在transwell實驗中，與對照組相比，DHPO處理的細胞顯著降低了GC細胞的侵襲能力（圖3D）。這些結果表明，USP7抑制劑DHPO在體外對胃癌細胞的致瘤潛能具有有效的抑制作用。
圖3 USP7抑制劑DHPO在體外具有抗胃癌（GC）活性
4. USP7抑制劑DHPO在體內表現出抗癌效果，且不引起明顯的宿主毒性
使用來自MGC803-Luc和MKN1-luc細胞系的原位腫瘤小鼠模型評估DHPO的體內療效和毒性（圖4A）。實驗組包括溶媒對照組和DHPO（5和10 mg kg - 1）處理組。與溶劑對照組相比，dhpo處理組的腫瘤生長顯著降低（P < 0.001）（圖4B，C，E，F）。通過監測體重變化來評估毒性。與溶劑對照組相比，在任何劑量下DHPO處理均未引起體重的顯著變化（圖4D，G）。轉移擴散是癌症的一個重要問題，尤其是胃癌，其轉移通常發生在肝臟和腹膜。我們研究了DHPO治療對肝、腹膜和脾轉移的影響。結果表明，與溶劑對照組相比，5 mg kg - 1和10 mg kg - 1劑量的DHPO均有效抑制了脾臟和肝臟中的轉移性腫瘤結節(圖4H；圖S2A，B，支持信息)。與溶劑對照組相比，對重要器官（包括肝、脾和腎）進行的組織學分析表明，兩個dhpo處理組均無毒性或損傷跡象（圖4I）。
圖4 USP7抑制劑DHPO在體內表現出抗癌效果，且不引起明顯的宿主毒性
5.USP7抑制劑DHPO誘導GC的鐵死亡
爲了深入研究DHPO在胃癌細胞中的作用機制，對DHPO或DMSO處理24 h的MGC803細胞進行了基於tmt的蛋白質組學研究。共有139個蛋白質顯示出顯著差異表達(≥1.3倍變化；P < 0.05);其中上調104個，下調35個。dhpo處理的MGC803細胞中差異表達的蛋白主要富集於鐵死亡途徑（圖5A）。鐵死亡以線粒體膜破壞、脂質過氧化、MDA蓄積和鐵過載爲特徵透射電鏡分析顯示dhpo處理的NUGC4細胞中線粒體皺縮，膜密度增強（圖5B）。與DMSO對照組相比，DHPO處理的MGC803和AZ521細胞中脂質ROS增加（圖5C，D）。有趣的是，之前報道的USP7抑制劑FT671和P5091不影響脂質ROS（圖5C，D）。爲了特異性敲低MGC803細胞中USP7的表達，我們使用靶向USP7的siRNA（圖5E）。值得注意的是，USP7敲低增加了脂質ROS的生成（圖5F）。爲了進一步驗證這些發現，我們使用靶向USP7的shRNA下調AZ521細胞中的USP7表達（圖5G）。至關重要的是，與對照細胞相比，USP7敲低細胞中的脂質ROS水平升高，並且這一效應在鐵死亡抑制劑Fer-1的作用下可逆（圖5H）。無論用DHPO、FT671或P5091處理MGC803和AZ521細胞，均觀察到MDA含量累積（圖5I）。在DHPO和FT671處理的AZ521細胞中觀察到鐵過載，但在P5091處理的細胞中未觀察到鐵過載（圖5J）。在靶向USP7的shRNA感染的MGC803細胞中也觀察到鐵過載，Fer-1可逆轉鐵過載（圖5K）。
圖5 USP7抑制劑DHPO促進胃癌鐵死亡
6.USP7通過去泛素化SCD來調節鐵死亡，以響應DHPO處理
爲了確定USP7調控鐵死亡的潛在底物，研究了DHPO處理後下調的前10個蛋白，如圖6A所示。在這些蛋白質中，SCD引起了我們的關注。SCD作爲一種參與單不飽和脂肪酸生物合成的酶，在調節脂質過氧化和鐵死亡中發揮重要作用。抑制或敲除SCD可增加脂質過氧化，使癌細胞對鐵死亡敏感，而過表達SCD則可防止鐵死亡現有文獻報道，抑制SCD可降低胃癌細胞增殖，促進鐵死亡這表明SCD可能是胃癌治療的一個有前景的治療靶點。Western blot和qRT-PCR檢測USP7抑制劑DHPO對MGC803、HGC27和AGS細胞SCD表達的影響。DHPO處理24 h後，SCD蛋白水平在所有細胞系中均呈濃度依賴性降低（圖6B），而SCD的mRNA表達在MGC803和AZ521細胞中呈濃度依賴性增加（圖6C）。此外，當放線菌酮抑制新蛋白合成時，DHPO縮短了SCD蛋白的半衰期（圖6D）。MG132阻礙了SCD蛋白的降解（圖6E），證實USP7通過泛素化-蛋白酶體途徑維持SCD蛋白的降解。基於這些發現，我們提出USP7通過將SCD去泛素化來調節鐵死亡（圖6F）。Co-IP驗證了USP7和SCD之間的蛋白相互作用（圖6G）。當使用靶向USP7的siRNA或shRNA敲低USP7時，SCD的表達水平降低（圖6H，I）。與對照組相比，在MGC803細胞中敲低USP7使SCD蛋白的半衰期從5 h縮短至2.5 h（圖6J，K），表明USP7參與了SCD蛋白的穩定。敲低USP7導致AZ521細胞中DHPO對SCD的抑制作用增強（圖6L），進一步證實USP7是DHPO的作用靶點。此外，USP7敲低增加了與SCD結合的多聚泛素鏈，表明USP7調節SCD的去泛素化（圖6M）。綜上所述，我們的數據表明，通過DHPO抑制USP7可增加SCD的泛素化並加速其蛋白酶體降解。
圖6 USP7抑制劑通過靶向假定的底物SCD誘導鐵死亡
7. USP7通過增加SCD水平促進腫瘤發生，並被用作獨立的預後生物標誌物
與從原位腫瘤小鼠模型獲得的結果一致，在GC PDX小鼠模型中，與對照組相比，兩種劑量的DHPO處理均導致腫瘤重量顯著降低（圖7A）。還研究了DHPO對總生存率的影響。結果表明，與對照組和順鉑治療組相比，DHPO治療顯著延長了生存期（圖7B）。第36日時，對照組的所有小鼠均死亡，而USP7抑制劑治療組超過一半的小鼠存活（圖7B）。順鉑治療組的生存率與對照組相似（圖7B），這表明在該模型中，傳統化療藥物對延長總生存期的作用有限。進一步分析顯示，與對照組相比，USP7抑制劑處理組對體重無明顯不良影響（P <0.05）（圖7C）。相比之下，順鉑處理組的體重與其他各組相比顯著下降（P <0.05）（圖7C），這反映了衆所周知的順鉑的細胞毒性作用。總體而言，我們的結果表明，5和10 mg kg - 1的DHPO治療均能有效抑制腫瘤生長，而不會對重要器官造成顯著毒性或損傷。4-HNE是脂質過氧化反應中含量最高的穩定終產物，具有高度毒性，與鐵死亡有關IHC結果顯示，與對照組相比，DHPO處理的小鼠腫瘤組織中4-HNE蛋白表達增加（圖7E），證實了DHPO在體內誘導GC中的鐵死亡。與體外GC細胞的結果一致，我們觀察到USP7抑制後，通過Western blot（圖7D）和IHC（圖7E）， GC PDX腫瘤中SCD表達顯著下調。這一發現表明，USP7抑制導致的SCD下調可能有助於體內腫瘤生長的抑制。爲了進一步研究USP7和SCD在時間和空間上的致癌作用，我們使用了scRNA-seq隊列[29]並鑑定了GC細胞羣。令人驚訝的是，我們發現USP7和SCD在惡性細胞中均表現出高表達（圖7F），進一步支持USP7和SCD是GC中的強效癌基因的觀點。因此，DHPO似乎是一種潛在的更安全的替代或補充治療GC的選擇。這些信息對於開發有效的癌症療法至關重要，這些療法可以延長癌症患者的生存期並改善其生活質量。
圖7 USP7-SCD軸與pdx荷瘤小鼠總生存期呈負相關
結論
綜上所述，本研究提供了USP7通過抑制鐵死亡作爲胃癌治療靶點的見解。這些發現爲利用USP7降解和誘導鐵死亡爲GC治療的潛在干預措施鋪平了道路。
Guan X, Wang Y, Yu W, Wei Y, Lu Y, Dai E, Dong X, Zhao B, Hu C, Yuan L, Luan X, Miao K, Chen B, Cheng XD, Zhang W, Qin JJ. Blocking Ubiquitin-Specific Protease 7 Induces Ferroptosis in Gastric Cancer via Targeting Stearoyl-CoA Desaturase. Adv Sci (Weinh). 2024 May;11(18):e2307899. doi: 10.1002/advs.202307899.
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